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Sunday, August 13, 2006

AISLAMIENTO DE ENTEROBACTERIAS PATOGENAS : COPROCULTIVO

OBJETIVO:
Identificar las especies patógenas de las vías gastrointestinales a través del coprocultivo y de sus reacciones bioquímicas


INTODUCCION

La alta incidencia de procesos infecciosos entéricos en la población en general, en países desarrollados y en vías de desarrollo, y sus elevados índices de morbi-mortalidad entre determinadas subpoblaciones (niños y ancianos), hacen que este tipo de patología siga cobrando gran interés desde el punto de vista clínico y microbiológico.
En países en vías de desarrollo suele ser la causa más frecuente de muerte y desnutrición en pacientes en edad pediátrica. En países desarrollados, debido al aumento de la calidad de vida, hay una disminución de la frecuencia y mortalidad, siendo la mayoría de los procesos autolimitados y resueltos con tratamiento adecuado.
FINALIDAD DEL COPROCULTIVO
La finalidad del coprocultivo es determinar el pronostico del o los agentes causantes de las infecciones intestinales y toxiinfección alimentaria estas por lo general están producidas por m. O. Pertenecientes a la familia de las entero bacterias no por ello se descarta a otros m. O. Como stafilococcus productores de entero toxinas Estreptococos , Clostridios , etc. Así como también virus , hongos y parásitos .
La búsqueda del agente causal no se descarta después de procesado una sola muestra ,la eliminación del posible agente patógeno se hace muchas beses en forma intermitente obligando al microbiólogo repetir el análisis por lo común después de una semana .
INDICACIONES DEL COPROCULTIVO
Generalmente suele indicarse en un cuadro entérico infeccioso persistente de más de 2 ó 3 días, se aconseja la toma de muestras para exámenes de laboratorio.
Se recomienda la evaluación del cuadro: su duración, su gravedad (grado de deshidratación, fiebre, sangre en heces, pérdida de peso, etc.); y la evaluación de los antecedentes clínicos del paciente: uso reciente de antibióticos (diarreas asociadas a uso de antibióticos), edad del paciente (los rota virus son la primera causa de gastroenteritis deshidratante en niños), ingestión de mariscos poco cocidos (orienta hacia la infección por vibriones o virus símil Norwalk), viajes a zonas tropicales (aumentarían las infecciones por parásitos, virus, y E. coli entero hemorrágico O157), en huéspedes inmuncomprometidos se tendrían que considerar un amplio espectro de agentes etiológicos (bacterianos, parasitarios, víricos y micológicos), en brotes epidémicos se debe orientar hacia la presencia de S. aureus, Cl. perfringens, Salmonella, Vibriones, Shigella, Campylobacter, E. coli, B. Céreus. Algunos de ellos escapan a la rutina diagnóstica (S. aureus, B. Céreus, etc.) porque lo que suele interesar es el estudio de su poder toxigénico. Finalmente en cuadros gastroentéricos que persisten durante más de 10 días, se recomiendan los exámenes parasicológicos.
ETIOLOGÍA
El número de microorganismos responsables de cuadros entéricos se ha ido ampliando debido al mejor conocimiento de los mismos y al desarrollo de métodos diagnósticos cada vez más sensibles.
Diversos microorganismos afectan directamente o a través de sus toxinas al tubo digestivo provocando cuadros diarreicos, dolor abdominal, vómitos, fiebre, etc.
Las infecciones gastrointestinales pueden tener una etiología bacteriana y/o toxiinfección alimentaría, vírica y parasitaria.
BACTERIANA : Entre las que incluiremos Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Shigella, Yersinia entero colitica ,E. Coli entero patógeno , Psedomonas , Aeromonas , hidrófila , Pleciomonas , B. Céreus , Clostridium difficile, Staphylococcus aureus, vibrios, y otras menos frecuentes como Mycobacterium tuberculosis .
VIRICA : Los virus productores de gastroenteritis son Rotavirus, Adenovirus, virus Norwalk, entre otros.
PARASITARIA : Los agentes etiológicos parasitarios pueden representar un amplio grupo de los que sólo mencionaremos algunos como Giardia lambia , Cryptosporidium, Entamoeba histolítica, Ciclos porra, Blastocystis, etc.
MICOTICA : levaduras como cándida albicans .
Al igual que en el caso de otras muestras humanas, sería conveniente que el clínico orientase al laboratorio sobre el proceso de infección y la etiología sospechosa. Todo ello repercutirá en beneficio del paciente, permitiendo ganar tiempo en la obtención del diagnóstico y disminuyendo el coste del precio del análisis.Esta orientación es de gran importancia, y en caso de no recibirla, sin ningún tipo de reparos debe ser el microbiólogo quien la solicite al médico para que le dé informes sobre detalles epidemiológicos, período de incubación, así como si el paciente cursa o no con fiebre. Es preciso recordar que las intoxicaciones alimentarias, es decir, las debidas a toxinas producidas fuera del hospedador y después ingeridas, generalmente no cursan con fiebre y tienen un período de incubación muy corto; en cambio, las producidas directamente por microorganismos cursan habitualmente con fiebre y tardan más en aparecer.
En la tabla 1 se justifica, en parte, lo expuesto.
RELACION ENTRE ALGUNOS TIPOS DE GASTROENTERITIS Y LA FIEBRE (1)




Microorganismos
Patología causada por (2)
Período de incubación (3)
Síntomas comunes (4)
Staphylococcus aureus.
Toxina (termoestable).
2-6 horas.
Náuseas, vómitos, calambres abdominales, diarrea (30 %), sin fiebre o muy poca.
Salmonella.
Infección
12-36 horas.
Diarrea, dolor abdominal, por lo común fiebre.
Shigella
Infección
24-72 horas.
Diarrea líquida con mucus; la fiebre es habitual
Clostridium perfringens.
Toxina (moderadamente termoestable)
6-12 horas.
Diarrea, calambres, sin fiebre o muy poca.
Clostridium botulinum.
Toxina (termoestable)
Variable (de horas a días)
Gastroenteritis inicial seguida por efectos de tipo curare.
(1) La tabla describe algunos microorganismos productores de gastroenteritis.(2) Patología causada por la producción de toxinas o por enteroinvasividad.(3) El efecto patológico se manifiesta generalmente antes si el microorganismo produce toxinas.(4) Entre los síntomas de gastroenteritis figura siempre la diarrea y sólo en los casos de infección es habitual la fiebre.
OBTENCIÓN DE LA MUESTRA
Se utilizaran heces recientes en un recipiente limpio de boca ancha y cierre hermético con un volumen mínimo de 2 a 4 g en heces pastosas y 5 a 10 ml en heces líquidas.
En general debe desaconsejarse el uso de hisopos rectales y restringirlo a casos excepcionales como en neonatos. En muestras digestivas se puede utilizar aspirado gástrico o duodenal.
Las biopsias y muestras obtenidas por endoscopia son fundamentales para la búsqueda de Helicobacter pylori (biopsia gástrica y duodenal).
La biopsia rectal es empleada para la detección de Entamoeba histolítica.
El meconio se suele utilizar para estudio periférico en neonatos con riesgo de sepsis.
En muestras para estudio parasicológico se envían con frecuencia estas en frascos cerrados con líquido conservador.
La obtención de la muestra se hará depositando directamente la misma en un recipiente estéril, para lo cual puede servir una placa de Petri o un frasco de boca ancha. En caso de no ser posible esta toma directa, se recogerá con una cuchara estéril alguna porción del material fecal recién emitido, que no haya entrado en contacto con el frasco receptor (orinal), y se verterá en un contenedor estéril.
Se recomienda procesar las muestras en el menor tiempo posible puesto que un numero de m. O. No sobreviven a lo cambios en el PH lo cual ocurre cuando baja la temperatura , esto es especialmente importante cuando se trata de Shigella y un numero apreciable de salmonellas , si se desea preservar las muestras se deben de someter a la acción de un preservante como el buffer fosfato 0.033 M mezclado con igual volumen de glicerina se estará frente a un PH de 7.0 . las muestras se obtienen por evacuación natural o mediante frotis rectal de una evacuación natural tomar las porciones que presenten mucosidad y sangre , cuando se obtiene la muestra por frotis rectal se debe de utilizar una torunda de 6" y sembrar inmediatamente en los medios apropiados o en su efecto colocar en un medio de transporte . este método de toma de muestra es por lo general utilizado en lactantes .
El producto así recogido se debe sembrar inmediatamente, incluso en la misma habitación del paciente si ello es posible, pues algunos patógenos intestinales, concretamente Shigella y algunas especies de Salmonella, sobreviven muy poco tiempo a los cambios de pH que sufren las heces en contacto con el ambiente. En caso de no poder sembrar la muestra «in situ», y ante la necesidad de mandarla a un laboratorio, aunque esté relativamente cercano, es conveniente enviar parte de ella, incluida en algún medio de transporte que mantenga el pH cercano a la neutralidad. Entre estos medios de transporte se pueden citar:a) Buffer fosfato 0,033 M, mezclado en partes iguales con glicerina.b) Medio tamponado con indicador (Sachs, 1939). Es parecido al anterior, con la innovación de incluir un indicador, que señala que el medio sólo se puede utilizar en condiciones de coloración rosa y que se debe desechar cuando adquiere tonalidad amarilla.c) Medio de Hajna. Es un excelente medio para el transporte de heces que contienen Salmonella o Shigella. Puede adquirirse comercializado en forma deshidratada y añadirle, una vez rehidratado, glicerina al 30 por 100.d) Caldo GN. Debido también a Hajna.e) Medio de transporte de Cary-Blair. Es quizá el más aceptado universalmente. Permite incluso la recuperación de anaerobios.
NÚMERO DE MUESTRAS
Si con la primera muestra no se detecta la presencia de entero patógenos, es necesario enviar dos tomas más en diferentes días.
MUESTRAS INADECUADAS
No se consideran adecuadas las heces emitidas no procesadas antes de 2 horas y no refrigeradas y el envío de tres muestras de heces el mismo día.
OBSERVACIONES
Las muestras deberán tomarse antes de la administración de antibióticos y se debe indicar siempre en el volante de petición el juicio diagnóstico de presunción, la edad y explícitamente algunas investigaciones especiales como toxina de C. difficile.
PROCESAMIENTO Y VALORACIÓN

OBSERVACIÓN DE LA MUESTRA
Se puede realizar un examen microscópico para detectar polimorfo nucleares (sugiere infección por un patógeno invasivo) y flora predominante.
Al recibir la muestra en el laboratorio se observarán detenidamente sus características, tales como el olor, color, consistencia, o la presencia de mucosidades, sangre, o restos de alimentos sin digerir. Estos detalles pueden orientar algo el diagnóstico; así, por ejemplo, unas heces líquidas con grumos en forma de agua de arroz, harán pensar en el cólera, o la sangre y mucosidades indicarán una sintomatología inflamatoria del intestino, que puede ser debida a una disentería.Hay autores que completan esta apreciación microscópica, mezclando en un porta una pequeña porción de heces con una gota de azul de metileno, tapándolo con un cubre y observando la preparación con objetivo de inmersión, intentando descubrir leucocitos. Su presencia denotará que hay inflamación en el intestino, la cual suele estar producida por agentes infecciosos invasores como Salmonella, Shigella o E. coli enteroinvasivo; en cambio, ante un proceso gastroenterítico, con heces exentas de glóbulos blancos, se sospecha una etiología virásica, o una bacteriana capaz de producir toxina, como vibrio cholerae, Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens, Clostridium botulinum o E. coli entero tóxico. Incluso hay investigadores que afinan más, y con una técnica de coloración como la de Wright, llegan a establecer las distinciones etiológicas expuestas en la tabla 2.
ENFERMEDADES GASTROINTESTINALES ASOCIADAS CON LEUCOCITOS FECALES
Enfermedad
Porcentaje de pacientes con leucocitosis fecal (1)
Tipo de leucocito predominante (2)
Shigelosis
100
Leucocitos polimorfo nucleares (media 84 %).
Salmonelosis (no por S. typhi)
82
Leucocitos polimorfo nucleares (media 75 %).
Fiebre tifoidea
100
Leucocitos mononucleares (media 95 %)
E. coli (invasor)
100
Leucocitos polimorfonucleares (media 85 %).
Colitis ulcerosa (activa)
100
Leucocitos polimorfonucleares (media 88%) (eosinófilos, media 8 %).
Disentería amebiana (activa)
Variable
Por lo general mononucleares, salvo infección bacteriana secundaria
Controles sanos, diarrea virásica, cólera.
0-10

La leucocitosis fecal se puede apreciar, simplemente, por observación entre porta y cubre.
El tipo de leucocitos se observa después de una coloración de Gram.
EXAMEN RUTINARIO
Consiste fundamentalmente en la inoculación de la muestra diluida en solución fisiológica en diversos medios de cultivo, alguno de ellos general como el Agar sangre para evaluación general de la flora.
Otros medios moderadamente selectivos para aislamiento de entero bacterias patógenas como MacConkey, Salmonella-Shigella, XLD (xilosa-lisina-desoxicolato), CIN (cefsulodina-irgasan-novobiocina) que permiten el crecimiento de Salmonella, Shigella, Yersinia. Sabouraud cloranfenicol para cándida cuando se presenta en disbacteriosis.
Medios líquidos de enriquecimiento, para la recuperación de algunos microorganismos, como el medio de Selenito
Medios para Campylobacter como el medio de Skirrow, en ambiente microaerofílico. También en este mismo ambiente, diversos medios como el Agar sangre, se pueden emplear para Helicobacter.
Detección de rotavirus y adenovirus en niños, especialmente en meses invernales y de temperatura templada.
CULTIVOS O PRUEBAS ESPECIALES
Se debe hacer constar en el volante de petición esa circunstancia. Por ejemplo para detección de Vibrio sp. con medios como agua de peptona y TCBS. En toxina de Clostridium difficile, especial atención a enfermos que hayan usado recientemente antibióticos durante algunos días.
Detección de toxina de E. coli entero patógeno O157H7 en heces hemorrágicas.
En los casos poco frecuentes de búsqueda de cepa Salmonella lactosa positiva, añadir a los medios habituales Agar sulfito bismuto o verde brillante. Aeromonas mesófilas con temperatura de incubación de 25 a 30 °C.
Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens y Bacillus cereus relacionados con brotes de toxiinfección alimentaria, sólo en laboratorios que realicen análisis de alimentos.
Ensayos para virus causantes de esta patología, como rotavirus, adenovirus , etc.
AISLAMIENTO Y CULTIVO
SIEMBRA DE MUESTRAS PARA BACTERIOLOGÍAPara hacer el coprocultivo, es decir, la siembra de las muestras fecales, se recogerán aquellas partes del contenido intestinal que llamen más la atención por su aspecto sanguinolento o mucoso, pues es allí donde abundan los microorganismos patógenos.La inoculación se efectuará sobre medios de cultivo propios y selectivos de los principales patógenos intestinales, incluyendo, dada su importancia, un medio de enriquecimiento para Salmonella (Selenito o tetrationato). Las cepas de Salmonella aisladas se identificarán por pruebas bioquímicas y se confirmará su identidad mediante un polivalente serológico. No es necesario que los pequeños laboratorios dispongan de todo el amplio material perecedero para serotipificar a Salmonella. La presencia de Shigella también se confirmará serológicamente
Es discutible la inclusión rutinaria de métodos y medios para el diagnóstico de Vibrio cholerae y Campylobacter. El primero porque es poco frecuente y además porque las características clínicas del paciente y las de la muestra ya orientarían hacia ello en caso necesario. El segundo porque, aunque actualmente ocupa el primer puesto en incidencia patológica intestinal, su metodología de cultivo e incubación resulta cara para una práctica sistemática de todas y cada una de las solicitudes. En este caso se valorará individualmente cada muestra, concediendo especial importancia a la edad del paciente y a la consistencia del producto.Todo lo tratado demuestra que la Microbiología es una ciencia viva, en constante desarrollo, y que su investigador, aunque tenga establecidos unos
esquemas teóricos a seguir, deberá en ocasiones hacer uso de improvisaciones prácticas, vinculadas a su experiencia científica.las muestras obtenidas según los métodos señalados estas deben ser procesadas en el menor tiempo posible utilizando para ello una torunda o una ansa de kolle sembrar mas o menos 1 g de muestra en los medios de enriquecimiento escogiendo de preferencia las porciones que presentan mucosidad y sangre paralelamente se deben sembrar en placas con agar Salmonella - Shigella , agar verde brillante , xld agar y agar mac conkey este ultimo con la finalidad de aislar E. Coli entero patógeno (EPI) muy común en las diarreas infantiles , los medios sembrados deben dejarse en incubación por 24- 48 horas a 37°C .
ESQUEMA A SEGUIR EN EL PROCEDIMIENTO PARA LA SIEMBRA DEL COPROCULTIVO











CONTROL E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS











CARACTERISTICAS DE BACTERIAS PATOGENASA continuación se precisan algunas características clínicas y de cultivo de las bacterias reconocidas como entero patógenas y se discuten las de alguna cuya etiología es dudosa.Salmonella : Las últimas tendencias en taxonomía aceptan el establecimiento de una sola especie de Salmonella. Le Minor, en la última edición de «EI Manual de Bergey» (1984), propone como única especie a Salmonella Choleraesuis subdividida en seis subespecies.En el XIV Congreso Internacional de Microbiología celebrado en Manchester (1986), el Comité Internacional de Sistemática Bacteriana a través del Subcomité Internacional de Enterobacteriaceae , ha decidido modificar el nombre de Salmonella Choleraesuis , propuesto por Le Minor, por el de Salmonella enterica , quedando los gérmenes conocidos tradicionalmente como S. Enteritidis , S. typhimurium, S. dublin, etc., en la categoría de serotipo, biotipo o bioserotipo dentro de su correspondiente subespecie (datos facilitados por el doctor Usera. Majadahonda).De forma general se podría decir que la Salmonella produce dos cuadros clínicos muy diferenciados, y que en ambos casos puede hacerse el diagnóstico a partir del coprocultivo.
Estos dos cuadros son la fiebre tifoidea y la salmonelosis gastrointestinal. El primero está producido por Salmonella Typhi y con menos frecuencia por Salmonella Paratyphi A y Salmonella Paratyphi B. El segundo está causado por otros serotipos como Salmonella Typhimurium, Salmonella Enteritidis, Salmonella Cholerae suis, etc. En contra de esta clara diferenciación, aceptada por todos, hay autores que señalan que pierde valor cuando se trata de niños, y que en ellos cualquier Salmonella puede producir los dos síndromes.El diagnóstico de la fiebre tifoidea puede hacerse por métodos directos y por métodos indirectos. Los primeros son aquellos que permiten aislar el microorganismo, como son: el hemocultivo y el coprocultivo. A veces, aunque es raro, se puede aislar también el germen de la orina.Los métodos indirectos son aquellos que ponen de manifiesto la acción del germen sobre el organismo, es decir, demuestran la presencia de anticuerpos específicos contra el agente etiológico.En este punto se podría cuestionar ¿qué métodos son mejores? ¿cuáles ayudan más a hacer el diagnóstico? La respuesta sería que todo depende del momento en que se halle la infección, del tiempo transcurrido desde el comienzo de la enfermedad.– El hemocultivo presenta un máximo de positividad durante la primera semana. – El coprocultivo permite aislar con un 30-50 por 100 de posibilidad Salmonella durante todo el transcurso de la enfermedad, siempre y cuando el paciente no esté bajo tratamiento, aunque el máximo de positividad se obtiene durante la segunda semana de evolución.Las técnicas indirectas, es decir, las serológicas, y, concretando más, las de aglutinación, tienen un máximo de efectividad a partir de las dos-tres semanas de evolución.Para aislar Salmonella, las siembras de las heces se efectuarán sobre medios de enriquecimiento (Selenito de Leifson, tetrationato de Kauffman, GN de Hajna, etcétera), y al mismo tiempo sobre medios selectivos (SS, Wilson Blair, desoxicolato citrato, Hektoen, etc.), resembrando a las doce-dieciséis horas de incubación un asa de las primeras en una placa de estos últimos. Con las colonias sospechosas se realizarán pruebas de identificación.En el otro síndrome clínico, es decir, la infección gastrointestinal, el coprocultivo es a menudo el único método que permite demostrar la etiología. El hemocultivo es sólo efectivo en algunas ocasiones.Shigella : Existen cuatro grupos de Shigella, representados respectivamente por Sh. dysenteriae, Sh. sonnei, Sh. flexneri, y Sh. boydii. Hoy en día se está intentando una tipificación por colicinotipia, es decir, por la susceptibilidad a las colicinas.La Shigella es un germen muy lábil y que resiste muy poco tiempo en las heces del organismo humano, a esto se debe la necesidad de sembrar lo antes posible las muestras sospechosas de contener Shigella. Incluso hay autores que recomiendan hacerlo en la misma habitación del paciente.El medio de cultivo más utilizado es el selectivo llamado SS, o Salmonella-Shigella, que se siembra con ún inóculo abundante.La Shigella es productora de la disentería bacteriana, y de muchas colitis en verano. A pesar de ser la responsable de las citadas enfermedades, en la actualidad la tendencia es no tratar las infecciones debidas a este microorganismo. En España no es frecuente la Sh. dysenteriae, siendo la más común Sh. sonnei.Muchos autores están de acuerdo en considerar que la Shigella causante de gastroenteritis bacteriana es eliminada por el efecto de arrastre de la diarrea, y por otro lado, su condición lábil les hace sensibles al resto de la flora bacteriana intestinal. Estos motivos justifican según los citados autores, la no utilización de antibióticos, que actuarían sobre la mayoría de gérmenes intestinales, eliminando la competencia, favoreciendo la aparición de resistencias y alargando el período de convalecencia. Esto transformaría al paciente en portador crónico.Precisamente fue en una Shigella, donde Watanabe, un investigador japonés, descubrió el fenómeno de la conjugación bacteriana, al comprobar la transmisión de trozos de DNA llamados plásmidos, de una bacteria a otra, a través de un canal protoplasmático que les conecta. Si en este trozo de cromosoma está codificada la resistencia a un antibiótico, o a un determinado grupo de antibióticos, la bacteria receptora se volverá, al igual que la donadora, insensible a los citados fármacos.De todas maneras, la cuestión de no establecer tratamiento es difícil para aquellos clínicos que están en contacto con los pacientes, sobre todo si éstos son niños.Según la misma idea antes aportada, tampoco sería correcto dar antidiarreicos, porque ello evita la expulsión de los gérmenes patógenos, los cuales, al quedar retenidos al abrigo intestinal aumentarán cuantitativamente, incrementando su agresividad sobre el tracto intestinal. En este punto es también necesario evaluar la necesidad de anteponer al citado efecto infeccioso, el hecho de evitar una deshidratación en el niño pequeño.
Vibrio : Hay varias especies del género Vibrio que son responsables de distorsiones intestinales. La más importante, Vibrio cholerae, produce su efecto gracias a una toxina muy semejante a la del E. coli entero patógeno. En los casos típicos, las heces presentan un aspecto conocido como agua de arroz, debido a su color blanco y consistencia líquida, con grumos que contienen gran cantidad de pequeños bacilos Gram. negativos ligeramente curvados.El aislamiento de las heces se hace utilizando medios selectivos, como el agua de peptona alcalina (pH 8,4), o el de Nakanishi modificado o TCBS, a base de tiosulfato, citrato, bilis y sacarosa.Otros vibrios semejantes al Vibrio cholerae, como su biotipo El Tor, y los vibrios NAG o no aglutinables, fabrican de igual forma la citada entero toxina, poseyendo estos últimos también un cierto efecto invasor del tejido intestinal.Si los vibrios NAG se encuentran principalmente en aguas dulces, el Vibrio parahaemolyticus vive en el agua del mar, dándose cada vez con mayor frecuencia cuadros de gastroenteritis transmitidos a partir de los llamados frutos del mar (mariscos y pescados poco cocidos).Yersinia : Es otro miembro de la familia Enterobacteriaceae que suele producir trastornos intestinales. De sus tres especies, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudo tuberculosis y Yersinia pestis, sólo las dos primeras están implicadas en los citados procesos, especialmente la inicial. La Yersinia pseudo tuberculosis se incluye, pues ha sido asociada últimamente en Rusia con cuadros entéricos, cuadros que ellos califican como fiebre escarlatinosa del Lejano Oriente.La Yersinia enterocolitica produce gastroenteritis aguda, caracterizada por fiebre, cefaleas, dolores abdominales agudos y diarrea líquida. También se ha implicado con otras afecciones abdominales con dolor, que se localiza en la fosa iliaca derecha, y que hace pensar en una apendicitis. Se trata de la linfoadenitis mesentérica aguda benigna, que no acostumbra a evolucionar con diarrea, y la única forma de hacer el diagnóstico es a partir de los ganglios.La Yersinia enterocolitica crece bien en medios ordinarios como el agar SS o el agar desoxicolato. Aunque las colonias aparecen a las cuarenta y ocho-setenta y dos horas, su pequeñez y poca proporción en ocasiones les hace pasar desapercibidas. Para facilitar su aislamiento se utilizan medios selectivo como el Drigalski Norwegian medium, el Oxalate «Y» médium, o el Wauters, y como enriquecimiento se usa el enfriamiento a 4° C durante tres semanas en Selenito o BHI. Lógicamente, los diagnósticos hechos con estos procesos de enriquecimiento no son válidos para implantar un tratamiento clínico, pero sí para estudios epidemiológicos.Hasta ahora no se han comercializado sueros anti-Yersinia que permitan confirmar la identificación bioquímica. Los laboratorios que quieran efectuar esta comprobación, pueden mandar las cepas a laboratorios de referencia.Indirectamente puede hacerse el diagnóstico enfrentando suero del paciente con una mezcla polivalente, o, cuando menos, que contenga los serotipos 3 y 9. Títulos iguales o superiores a 1/160 son significativos.Escherichia coli : Gracias a los trabajos empezados por Kauffmann, y sobre la base de 157 antígenos somáticos (0), 93 capsulares (K) y 52 flagelares (H) de los que hay tres variedades (L, A y B), es posible identificar serológicamente a E. coli.Esta determinación serológica, en la práctica diaria de los laboratorios de microbiología, sólo se realiza para la investigación de una serie de Escherichia coli denominados entero patógenos, y cuya patología parece reducirse a gastroenteritis infantiles en niños menores de dos años y medio.Ahora bien, en la actualidad se duda de su verdadera intervención, pues es posible aislarlos de muchas heces infantiles que no tienen síntomas de gastroenteritis. Nuestra opinión es que sólo es valorable en caso de epidemias en las que se aísle un solo serotipo. En casos aislados sólo podremos imputarle con seguridad la etiología del proceso si comprobamos su capacidad entero patogénica. E. coli entero patógeno puede efectuar de dos maneras su acción intestinal, una produciendo entero toxinas, de las cuales se conocen dos (ST o estable al calor y LT o lábil al calor, que es parecida antigénicamente a la entero toxina de V. cholerae ) y otra por la invasión de las células epiteliales del intestino, produciendo un cuadro disenteriforme, denominándose respectivamente E. coli enterotoxigénico y E. coli enteroinvasivo.La capacidad entero tóxica por producción de LT se investiga inoculando extracto bruto del cultivo sobre células Vero y observando cambios celulares debidos a alteraciones del contenido en AMP cíclico.La capacidad entero tóxica por ST se demuestra inoculando extracto bruto de su cultivo en ratones lactantes de uno a tres días.La propiedad enteroinvasiva se pone de manifiesto por el test de Anton, inoculando 10 e8 células bacterianas en el saco conjuntival de cobayas, y observando, en caso positivo a las veinticuatro-cuarenta y ocho horas, la producción de una inflamación corneo-conjuntival.Como se comprenderá, estas técnicas generalmente no están al alcance de laboratorios pluridisciplinarios, por lo que es aconsejable mandar la cepa a laboratorios especializados para que hagan su estudio, hecho que, por otro lado, no solucionará el problema, ya que cuando se consiga el resultado, el paciente probablemente estará ya curado.Por otro lado es difícil establecer una relación entre enteropatogenicidad y serotipo de E. Coli, ya que los factores entero patogénicos conocidos hasta ahora: capacidad de producir entero toxinas (ST y LT) e invadir la mucosa intestinal, dependen de plásmidos independientes del material genético que codifica su estructura antigénica. En consecuencia, sería necesario estudiar, por un lado, la capacidad entero patogénica, por otro lado, el serotipo y, finalmente, la presencia del plásmido «ent».Anaerobios esporulados : Los anaerobios esporulados no suelen producir infecciones gastrointestinales, y en la literatura sólo se cita con escasa frecuencia la presencia de Clostridium perfringens causante de intoxicaciones alimentarias. También se han mencionado casos de colitis pseudo membranosa debidos a Clostridium difficile.Otros microorganismos que con menor frecuencia se consideran responsables de gastroenteritis son los siguientes:Cándida : sobre todo Cándida albicans, que es aislada mayoritariamente de heces patológicas de niños pequeños. En ocasiones es posible su hallazgo en el contenido fecal de adultos con trastornos intestinales recién llegados de patses del Medio y Lejano Oriente (Egipto, India, etcétera).Pseudomonas : Frecuente en personas tratadas largo tiempo con antibióticos de amplio espectro.Staphylococcus aureus : Su presencia es favorecida también por terapia con antibióticos de amplio espectro. Además de este efecto por sobrecrecimiento, son muy frecuentes las intoxicaciones alimentarias por la entero toxina, producida por el microorganismo.Campylobacter : Desde hace algún tiempo se reconoce a Campylobacter jejuni como el patógeno intestinal con mayor morbilidad. Generalmente afecta a niños pequeños, a los que produce diarrea, dolores abdominales, fiebre, náuseas y a veces vómitos.La fuente de infección suele ser el agua, o, más frecuentemente, los alimentos de origen animal. También se encuentra en abundancia en las heces de animales domésticos.El desarrollo de su patología no está bien definido, ya que mientras que, por un lado, produce manifestaciones enteroinvasivas (con producción de sangre y leucocitos), por otro, hay constancia de que libera una entero toxina similar a la de Vibrio cholerae y E. coli enterotoxigénico.Para el diagnóstico microbiológico, la siembra de las heces debe hacerse muy rápidamente, preferiblemente antes de dos horas. En caso de no ser posible, se incluirá la muestra en un medio de transporte adecuado (el mejor es el de Cary-Blair).Para el cultivo de Campylobacter se precisan unas condiciones especiales, que son: disponer de un medio selectivo, temperatura de incubación de 42-43° C y atmósfera microaerofílica (reducida de oxígeno) con C02.Hay varios medios de cultivo selectivos apropiados, la mayoría de ellos comercializados, como el Skirrow, el Butzler o el Campy BAP, no siendo necesario utilizar ningún medio de enriquecimiento previo.
La incubación a 42-43° C se realiza por espacio de cuarenta y ocho-setenta y dos horas en una atmósfera que contiene un 5 por 100 de 02, 10 por 100 de C02 y 85 por 100 de N2. Hay casas comerciales que preparan sobres generadores de este tipo de atmósfera. Las placas pueden incluirse dentro de jarras de anaerobiosis, donde se incorporan también estos sobres.Con las colonias sospechosas crecidas en los medios antes mencionados, se efectúa una identificación presuntiva, observando su morfología vacilar Gram. negativa en espiral (es mejor usar como colorante de contraste fucsina fenicada al 0,3 por 100), su movilidad característica y la capacidad de dar positiva la prueba de la oxidasa.Se puede completar la determinación con una batería de pruebas bioquímicas, de las cuales destacamos la catalasa, la reducción de nitratos, la producción de SH2 y la hidrólisis del hipurato.Aeromonas : Aeromonas hydrophila se aísla con relativa frecuencia de heces diarreicas, habiéndose comprobado su capacidad entero tóxica y enteroinvasiva. Hay autores que también implican en estos procesos a Pleciomonas shigelloides.Otros entero patógenos son Edwarsiella, Streptococcus faecalis variedad liquefaciens, que produce toxiinfección, y Bacillus cereus, que da lugar a intoxicaciones.
ESTUDIO DELOS DIFERENTES AGENTES PATOGENOS INTESTINALES
GENERO : CAMPYLOBACTER
Son pequeños bacilos Gram- que tienen forma de coma, forma espiral y, en ocasiones, también se les puede observar en forma de "S". Son microaerofílicos, móviles por un único flagelo polar y no esporulados. No fermentan carbohidratos y dan positiva la prueba de la Oxidasa y la Catalasa.
Campylobacter suele encontrarse en el tracto gastrointestinal de un gran número de animales y en el hombre producen infecciones gastrointestinales. También se les asocia, aunque en menor grado a infecciones extraintestinales, sobre todo en pacientes con SIDA.

ESPECIES CLÍNICAS
Las más importantes para el hombre, y que son agentes etiológicos de la diarrea son:
Campylobacter jejuni
Campylobacter coli
Campylobacter laridis
El Campylobacter fetus subespecie fetus produce cuadros de septicemia en pacientes con un sistema inmunitario deficiente.

Aislamiento a partir de muestras clínicas
Cuando se trata de un aislamiento a partir de heces es recomendable hacer el análisis lo más pronto posible. Si se va a retrasar, es necesario usar un medio de transporte: Cary Blair ó Campy-Thio, en los cuales se mantiene de 1 a 2 semanas a 4ºC.
Las condiciones bajo las cuales deben realizarse los cultivos son:
Utilizar medios de cultivo selectivos para estos microorganismos.
Temperatura de incubación de 41ºC (porque los más importantes son termofílicos).
Condiciones reducidas de Oxígeno (microaerofílicos).

Medios Selectivos
Skirrow
Campy-BAP
Butzler
Generalmente no se suelen usar medios de enriquecimiento cuando la muestra procede de heces. Sí es útil en aquellos casos en que está disminuido el número de bacterias por haber permanecido las heces durante un tiempo a temperatura ambiente.
También es importante usar un medio de enriquecimiento cuando la muestra procede de personas que están en tratamiento o en portadores.

Incubación
Se deben incubar a 42ºC durante unas 72 horas, en el caso de Campylobacter jejuni y C.coli. De esta forma eliminamos la flora acompañante.

Para otras especies de Campylobacter:
Utilizar medios selectivos sin cefaloesporinas
Incubación a 37ºC durante 7 días en atmósfera microaerofílica.
Métodos alternativos para el aislamiento de Campylobacter en heces

§ Filtrar las heces (eliminamos coliformes y flora contaminante), diluir y se siembra en un medio NO selectivo. Se incuba a 42ºC en ambiente microaerofílico.
§ Colocar directamente el filtro sobre la superficie del agar. Echar 1 o 2 gotas de las heces sobre el filtro. Hacer una primera incubación, retirar el filtro y volver a reincubar.
Aislamiento de Campylobacter a partir de muestras de sangre
Se aíslan en sangre: C. fetus, C. jejuni, C. laridis y otros que generalmente pueden aislarse en sangre como agentes etiológicos de sepsis en pacientes con el sistema inmunitario deprimido o en enfermos de SIDA.
Aunque la mayoría crecen bien en medios con sangre, tienen el inconveniente de que tardan hasta 2 semanas en desarrollarse en estos medios. Es preferible realizar un cultivo en medios líquidos y, a partir de estos, realizar subcultivos en medios sólidos, en ambiente microaerofílico y a una temperatura de 37ºC.
IDENTIFICACIÓN
La identificación cuando se sospecha la presencia del Campylobacter consiste en una TINCIÓN DE GRAM, en la cual se observan como bacilos Gram- que pueden adoptar una forma de "S", aunque cuando la tinción de Gram se realiza a partir de cultivos viejos pueden perder esta morfología.
También se puede hacer un MONTAJE EN FRESCO para observar la movilidad; las pruebas de la OXIDASA y la CATALASA darán positivas y, para la diferenciación entre especies se pueden realizar las siguientes pruebas:
Crecimiento a distintas temperaturas
Sensibilidad que presentan al ácido nalidixico y cefalotina
Producción de SH2 en Agar Hierro de Kliger
Reducción de Nitratos
Además de estas pruebas también se puede realizar la SEROTIPIFICACIÓN mediante técnicas de Hemaglutinación Indirecta y Técnicas de Aglutinación en portaobjetos.
PATOGENIA. PATOLOGÍA
El que tiene mayor importancia desde el punto de vista clínico es el C. jejuni:
Campylobacter jejuni da lugar a gastroenteritis que se manifiesta con un cuadro diarreico y, en ocasiones puede observarse la presencia de sangre en heces. Este m.o se adquiere generalmente por vía oral como consecuencia de la ingesta de alimentos o bebidas contaminadas. También se puede producir por contacto con animales infectados.
C. jejuni es un m.o muy sensible al pH ácido del estómago por lo que debe ingerirse un elevado número de m.o para que se produzca la infección.
Se multiplica en el intestino delgado, invade el epitelio y produce inflamación. En ocasiones también puede pasar al torrente circulatorio y desarrollar un cuadro de fiebre entérica. La diarrea que produce suele acompañarse de dolor abdominal, cefalea y fiebre.
Campylobacter coli y Campylobacter laridis producen una infección gastrointestinal similar a la producida por C. jejuni.
Campylobacter fetus y C. upsaliensis producen cuadros diarreicos en individuos normales y pueden ocasionar bacteriemia en pacientes con el sistema inmunitario deprimido.
HELICOBACTER PYLORI
Se aísla en el estómago de pacientes con lesiones gástricas y úlcera gástrica. Es un bacilo Gram- con forma espiral y con una gran actividad ureasa. Es un m.o móvil y el interés en él reside en que se le considera como un importante factor de lesiones gástricas.
DETECCIÓN
Se pueden realizar MÉTODOS DIRECTOS dado que este m.o se localiza preferentemente en los pliegues de la mucosa del estómago. Las pruebas más idóneas para el aislamiento del mismo serán las biopsias de las zonas lesionadas (IMP: Las muestras deben proceder de Biopsias, NO de aspirados gástricos). Cuanto mayor sea el número de biopsias que se realicen, mas posibilidades habrá de conseguir el aislamiento de este m.o.
Las muestras procedentes de biopsias deben enviarse directamente al laboratorio para proceder a su cultivo y, si esto no fuese posible, es necesario utilizar un medio de transporte: Solución glucosada al 20%; Solución Salina o Caldo Tioglicolato. En estos medios de transporte, el microorganismo se mantiene viable durante aproximadamente 5 horas si la temperatura de conservación es de 4ºC.
De las biopsias, una parte se utiliza para la realización de un frotis (TINCIÓN DE GRAM ó GIEMSA). En la tinción de Gram se observan bacilos Gram- con forma de espiral o una forma característica denominada forma de "U" o de "Arnés de bueyes".
El resto de la muestra de la biopsia se trocea o machaca en un mortero estéril y posteriormente se siembra.
Además de las tinciones también se pueden realizar PRUEBAS BIOQUÍMICAS como la prueba de Reducción de Nitratos y la prueba de la Ureasa:
Prueba Rápida: se realiza a partir de la muestra de la biopsia que se inocula en un medio para la determinación de urea, como por ejemplo, Caldo de Urea o Cristensen. Evidencia, cuando es positiva, que puede tratarse de H. Pylori.
Prueba de la Urea Respiratoria: el paciente ingiere una urea marcada y tras un período determinado de tiempo se mide el nivel de CO2 espirado.
Además de estos métodos también se utilizan los MÉTODOS SEROLÓGICOS que utilizan técnicas de ELISA con las que pueden ponerse de manifiesto la presencia de IgG e IgA.
MEDIOS DE CULTIVO
Los medios de cultivo utilizados para el aislamiento de Campylobacter procedente de estas biopsias son:
Agar Mueller-Hinton con 5% de sangre de carnero
Agar Brucella con 1% de almidón soluble
Agar sangre-chocolate-Skirrow-Thayer Martín, siempre que estén suplementados o bien con suero o bien con almidón.
Además de estos medios se pueden usar medios SELECTIVOS que incorporan antibióticos con el fin de inhibir la flora acompañante:
Medio selectivo para Helicobacter pylori
Medio Belo Horizonte
La temperatura óptima de crecimiento es de 37ºC, en ambiente microaerofílico, y la incubación debe mantenerse al menos durante 7 días cuando se trata de aislamiento primario.
FACTORES DE PATOGENICIDAD
Producción de Ureasa ® Crea un ambiente alcalino (CO2 y NH3) que le protege de la acidez gástrica.
Proteasas ® Modifica el pH gástrico de la mucosa.
Hemaglutininas ® Se adhieren a las células epiteliales.
Citotoxinas (no tienen un papel determinado).
PATOLOGÍA
Gastritis aguda
Úlceras pépticas: H. Pylori se ha aislado en el 100% de los enfermos que padecen úlcera duodenal y en un 80% de los enfermos que padecen una úlcera gástrica.
PSEUDOMONAS
Las especies de este género son bacilos Gram-, aerobios estrictos, Oxidasa+ y móviles por un flagelo polar. No fermentan ningún tipo de carbohidrato pero pueden utilizar los azúcares por metabolismo oxidativo.
Pseudomona aeruginosa
Es un m.o que crece bien en la mayor parte de los medio habituales de laboratorio, entre ellos MacConkey y Levine. No fermenta ningún carbohidrato y es capaz de crecer a temperaturas de 42ºC.
En Agar Sangre da lugar a colonias de morfología variable, en ocasiones b-hemolíticas y con un olor característico a fruta. Elabora pigmentos hidrosolubles que colorean el agar como la "piocianina" de color azul, "pioverdina" de color verde y "piorrubina" de color rojo. Es la única especie que produce piocianina, característica que se puede utilizar para su identificación. La producción de pigmentos se puede potenciar recurriendo a medios especiales como, por ejemplo, el King A y el King B.
Además existen medios selectivos para el aislamiento de P.aeruginosa a partir de muestras contaminadas como heces y esputo como son el Agar Cetrimida y el Agar Irgarsen.
IDENTIFICACIÓN DE LA P.AERUGINOSA
Las características que ayudan a la identificación de P.aeruginosa son:
- Crecimiento en la mayor parte de los medios de cultivo
- En Agar Sangre dan colonias azul-verdosas con olor afrutado
- Catalasa y Oxidasa+
- Reducción de Nitratos
- Crecimiento a 42ºC
- En Agar de Kligler produce un crecimiento en superficie sin viraje del medio
- Oxidación de Glucosa en un medio de Oxidación-Fermentación.
- Hidrólisis de Arginina
- No decarboxilan ni Lisina ni Ornitina
- Tolerancia a la Cetrimida

PATOGENICIDAD Y PATOLOGÍA DE LA P.AERUGINOSA
La P.aeruginosa posee un gran número de factores de virulencia que se encuentran implicados en los mecanismos de patogenicidad del m.o, entre ellos fimbrias, que permiten su adherencia a células epiteliales; cápsula polisacárida, que le protege de la fagocitosis; enzimas extracelulares, como proteasas, hemolisinas y coagulasas; y endo y exotoxinas.
Posee además, la capacidad de sobrevivir en medios con bajo contenido en nutrientes, especialmente en ambientes húmedos, de forma que se ha llegado a aislar en agua destilada y soluciones desinfectantes.
P.aeruginosa se haya implicada en un gran número de procesos infecciosos aunque siempre como patógeno oportunista y en pacientes con algún tipo de alteración en su inmunidad. Es causante de infecciones nosocomiales. Puede producir también infecciones oculares asociadas al uso de lentes de contacto, otitis media en nadadores y, en ocasiones, puede producir septicemias.
Pseudomona mallei y Pseudomona pseudomallei
Son las únicas especies del grupo consideradas como verdaderos patógenos.
P.mallei es el agente etiológico del "Muermo", enfermedad que se transmite al hombre a través del ganado equino. A deferencia del resto de las especies del género, no habita ni en el agua ni en el suelo, sino que se encuentra perfectamente adaptada al hombre y animales a quien parasita.
P.pseudomallei es de vida libre y se encuentra en el agua y en el suelo. Es el agente etiológico de la "Meliovidosis", una infección rara en nuestro medio y que se manifiesta de diversas formas, como infección pulmonar, abscesos, septicemia, etc. En el laboratorio crece en agar sangre dando colonias umbilicadas, de crecimiento lento y con una zona de hemólisis alrededor. Puede crecer en Agar MacConkey y a temperaturas de 42ºC.
Otras Pseudomonas
- P.cepaia: produce fibrosis quística
- P.fluorescens, P.pútida, P.putrefaciens y P.alcaligenes: se suelen aislar como agentes infecciosos en pacientes cuyas defensas se encuentran comprometidas.
GENERO : ACINETOBACTER
Este género engloba m.o que se encuentran habitualmente en el suelo y en el agua. Se puede hallar presentes en ambientes hospitalarios, donde producen infecciones en pacientes con las defensas disminuidas.
Dos especies son las que se aíslan con más frecuencia:
A.calcoaceticus-subespecie anitratus
A.calcoaceticus-subespecie Iwoffi
Estos m.o se han aislado en pacientes con neumonía, infección urinaria y sepsis. En el laboratorio crecen en Agar MacConkey y en Agar Sangre donde dan colonias grises rodeadas de una zona de hemólisis.
Se diferencian de las Pseudomonas porque dan negativa la prueba de la Oxidasa, son Catalasa+ y no reducen los Nitratos.
Al microscopio se observan como bacilos Gram- que, en ocasiones, pueden confundirse con las Neisserias.

ENERO :BRUCELLA

Son Coco-Bacilos, Gram-, inmóviles, no esporulados y aerobios estrictos. Algunas especies de Brucellas pueden presentar cápsula.
Al microscopio se observan agrupados en parejas o formando cadenas cortas. La temperatura óptima de crecimiento es de 35-37ºC.
Son Catalasa+. La mayor parte de las Brucellas dan positiva la prueba de la Oxidasa y reducen los Nitratos a Nitritos.
Las especies de Brucellas son parásitos obligados de animales y, algunos de ellos, producen infección en el hombre.
DIAGNÓSTICO A PARTIR DE MUESTRAS CLÍNICAS
Examen Directo: El examen de la muestra, previa tinción de Gram, ofrece pocos resultados, debido al escaso numero de m.o que puede contener. La técnica del Ac fluorescente directo, que emplea Ac anti-Brucella marcados con fluoresceína, proporciona mejores resultados que la tinción de Gram.
Las tinciones ofrecen un diagnóstico de presunción que no es definitivo por lo que siempre hay que realizar el cultivo de las muestras.
Aislamiento de la Brucella. Medios de cultivo: realizamos el aislamiento cuando no se puede realizar la identificación directamente de la muestra clínica.
Las Brucellas son m.o intracelulares, por lo que necesitan requerimientos nutricionales complejos.

El cultivo se realizará, por lo tanto, en medios enriquecidos, aunque hay Brucellas que se pueden desarrollar en medios generales como Agar Sangre y Agar Chocolate:
Medios de cultivo Líquidos: Caldo Brucella.
Medios de cultivo Sólidos: Agar Brucella complementado con suero o glicerina.
Medios de cultivo Selectivos: Medio de Farell; Medio modificado de Thayer-Martin.
A todos los enfermos sospechosos de infección por Brucellas se les debe realizar un hemocultivo.
Identificación de Brucellas
Basada en la Morfología de las colonias:
- Lisas y transparentes: están relacionadas con la presencia de cepas virulentas. Presenta tanto la parte lipídica A como la parte polisacárida O.
- Rugosas: están relacionadas con cepas avirulentas. Sólo poseen la parte lipídica A, y si poseen la parte polisacárida, ésta es defectuosa, por lo que no se consideran virulentas.
Otra forma de diferenciar las formas virulentas de las avirulentas es sembrar en un medio Agar Glucosa Glicerol. Una vez incubada la placa inundamos la superficie de la placa con una solución de cristal violeta y observamos con una luz oblicua. Las colonias lisas se observarán de un azul verdoso, mientras que las colonias rugosas se observarán de un azul rojizo o violeta rojizo.
Tinción de Gram:
Las Brucellas aparecen como coco-bacilos Gram- que se tiñen débilmente con el colorante de contraste, por lo que es necesario mantener la acción del colorante de contraste (Safranina) por lo menos durante 3 minutos.
Es conveniente, antes de hacer la tinción de Gram, que si se sospecha la presencia de Brucellas, hagamos una suspensión de una colonia en una solución salina fenicada al 1%, para evitar riesgos.
Pruebas Bioquímicas:
Son Catalasa+, la mayoría dan positiva la prueba de la Oxidasa, son Ureasa+, reducen los Nitratos a Nitritos y no fermentan la Glucosa ni la Lactosa.
DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO: (diagnóstico indirecto)
Prueba de la Rosa de Bengala
Aglutinación en tubo
Prueba de antiglobulina para Brucella (Coombs indirecto)
La Prueba de la Rosa de Bengala y la aglutinación en tubo se realizan de la misma forma. Son pruebas de aglutinación que se realizan con una suspensión de Brucellas a pH = 3,6. Para la prueba se preparan una serie de diluciones:
Dilución 1/2 :100mL de suero problema + 100mL solución salina
Dilución 1/4 : 100mL dilución anterior + 100mL solución salina
Dilución 1/8: 100mL dilución anterior + 100mL solución salina
...etc.
Una vez hechas las diluciones, colocamos 50mL de las mismas en un porta y le añadimos 1 gota de la suspensión de Brucellas.
Primero se detecta la presencia de la Brucella y después se realiza la cuantificación de la misma. Para que la prueba se positivice, el paciente debe tener una concentración de Ac en suero de 25 UI/mL o superior. Para conocer este dato calculamos el título:
TÍTULO = 25 UI/mL x Inversa de la Dilución
Las pruebas se deben repetir a los 15 días después de la seroconversión:
Siempre que aumenta el título de Ac de una fase a otra significa que se encuentra en una fase aguda.
Si el título se mantiene, pueden darse dos situaciones:
- Que se trate de Ac residuales
- Que se trate de una infección crónica
La Prueba de la antiglobulina para Brucella ó Coombs indirecto sirve para detectar Ac bloqueantes (IgA, que se encuentran en las mucosas)
Enfrentamos el suero de paciente con la solución de brucellas e incubamos. El Ac bloqueante se une al Ag, pero no produce la aglutinación. Para saber si realmente existe el Ac bloqueante o simplemente es que no existe, añadimos la antiglobulina humana o suero de Coombs.
Si se produce la aglutinación significará que en el suero del paciente existía el Ac bloqueante, ya que la antiglobulina humana se ha unido a este Ac y ha aglutinado.
Si no se produce la aglutinación significa que no existía Ac en el suero del paciente.
EPIDEMIOLOGÍA DE LAS BRUCELLAS
Las principales especies de Brucella con importancia patológica son:
B. melitensis: produce la mayor parte de los casos de Brucelosis que se producen en España.
B. abortus: producen una infección más leve que la melitensis. A veces cursa de forma asintomática y es la causante de muchos de los abortos espontáneos que se dan en los animales.
B. suis: suele afectar al ganado porcino pero tiene menos importancia desde el punto de vista clínico.
La Brucelosis es una antropozoonosis, es decir, que afecta a los animales de forma primaria y pueden transmitirse al hombre. La infección puede producirse tanto por:
Contagio Directo: se puede producir como consecuencia de un contacto con animales infectados o bien por inhalación de aerosoles, o por contacto de productos infectados con las mucosas.
Contagio Indirecto: se produce como consecuencia de ingestión de leche y sus derivados que no han sido pasteurizado.
Es importante destacar el peligro que supone para el personal sanitario la manipulación de muestras sospechosas de Brucelosis ya que es fácil que pueda producirse el contagio por contacto con piel y mucosas, por inhalación de aerosoles y por accidentes como consecuencia de la manipulación de agujas contaminadas en la realización de los hemocultivos.
PATOGENIA
Generalmente, las Brucellas tienen un período de incubación que puede oscilar entre 1-6 semanas. Durante este período, las Brucellas se multiplican en el interior de las células del retículo endotelial y, de esta forma, elude la respuesta inmune del huésped.
Pueden pasar a la sangre y diseminarse en los tejidos. Es frecuente que la infección se localice en algún órgano, generalmente hígado y médula ósea.
ENTEROBACTERIAS.
Son bacilos Gram-; Catalasa+; Oxidasa-; anaerobios facultativos...
Fermentan la glucosa con producción de ácido, con ó sin gas.
La mayor parte reduce los nitratos a nitritos, pueden ser móviles o inmóviles. Cuando son móviles, la mayoría presenta flagelos perítricos.
Están ampliamente distribuidas en la naturaleza, habitan tanto a plantas como animales y suelo, y en el hombre se encuentran como flora comensal en el intestino. Son responsables de un gran número de infecciones, siendo particularmente frecuente su aislamiento a partir de determinadas muestras clínicas. Son responsables del 50% de los casos de septicemia; de 60-70% de los casos de enteritis bacteriana aguda y más del 70% de los casos de infecciones del tracto urinario.
ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
§ Ag somático O: se encuentra en la pared celular y tiene naturaleza polisacárida.
§ Ag capsular K: polisacárido o proteína.
§ Ag flagelar H: naturaleza proteica.
§ Endotoxinas.
§ Exotoxinas.
§ Colicitinas: Son bacteriocinas,. Son toxinas contra otras cepas de la misma o distinta especie.
Ø AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN
Todas aquellas muestras clínicas en las que se sospecha la presencia de Enterobacterias, generalmente procedentes de heridas, líquidos y exudados orgánicos, orina y hemocultivos, deben sembrarse en un medio general (Agar sangre o chocolate) ó en un medio selectivo.
Si la muestra procede de heces o hisopos rectales, se utilizarán medios selectivos diferenciales ó caldos de enriquecimiento.
MEDIOS DE CULTIVO
En función del origen de la muestra, podemos utilizar distintos medios de cultivo. Los que se utilizan más frecuentemente son:
§ Medios de cultivo poco selectivos:
- Agar Mc Conkey
- Agar EMB Levine
§ Caldo de crecimiento:
- Selenito-Salmonella
- Tetrationato-Salmonella-Shigella (Toxoinfecciones alimentarias)
§ Medios de cultivo de Selectividad media-alta:
- Agar enterico Hecktren
- Agar salmonella-Shigella
- Agar verde brillante (para todo tipo de Salmonellas, excepto la S. typhi)
- Agar bismuto sulfito (selectivo para S. typhi)
PROCEDIMIENTOS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIACEAS
§ Pruebas Bioquímicas.
§ Sistemas comerciales de identificación.
§ Identificación serológica: permite la identificación a nivel de género y especie.
§ Diagnóstico inmunológico.

PRUEBAS BIOQUÍMICAS
Agar hierro de Kligler: Es una prueba diferencial y además se trata de una multiprueba. Se compone de dos hidratos de carbono (Lactosa en un 1% y Glucosa en un 0,1%). La Glucosa se encuentra en menor cantidad para que se consuma antes de las 24 horas de incubación y necesariamente las bacterias tengan que consumir las peptonas, con lo que se produce amoníaco y se alcaliniza el medio.
3 formas básicas de fermentación en este medio de cultivo:
§ Que solamente se fermente la Glucosa: por principio, todas las enterobacteriaceas fermentan la glucosa. Cuando la glucosa se acaba y la bacteria no es capaz de utilizar la lactosa, se alimentará de las peptonas del medio.
Método: la siembra se hace en profundidad (condiciones anaerobias) y en superficie (condiciones aerobias). La muestra debe proceder de un medio de cultivo puro, se tomará una colonia con un hilo de siembra y se hará la inoculación del medio de cultivo primero en profundidad, y segundo, según sacamos el asa, en superficie. La lectura se realizará tras un tiempo de incubación de 24 horas (que se ha de cumplir a rajatabla) a 35-37ºC.
Resultados: Si se fermenta la Glucosa, se producen unos compuestos que acidifican el medio y, por lo tanto, el medio virará a "amarillo". Si además de la Glucosa utiliza las peptonas, que producen amoniaco, el medio se alcaliniza y en lugar de virar a amarillo virará a "rojo intenso". Esto último solo ocurre en la siembra que se ha hecho en la superficie, es decir, que veremos la superficie roja y el fondo amarillo. Esto es así porque los productos metabólicos son diferentes si la transformación es aeróbica o anaeróbica.
§ Que fermente tanto la Glucosa como la Lactosa: Se observará el medio totalmente amarillo, debido al pH ácido.
§ Que no fermente ninguna: se alimenta desde el principio de las peptonas, por lo tanto podremos afirmar que no se trata de una Enterobacteria. Se originarán una serie de productos alcalinos que virarán el medio a rojo tanto en el fondo como en la superficie, siempre y cuando la bacteria sea capaz de consumir las peptonas tanto en medio aerobio como anaerobio. Si la bacteria solo fuera capaz de utilizar las peptonas de forma aerobia, la superficie aparecería roja, mientras que el fondo permanecería sin cambios.
2 Observación de la producción de gas (CO2 y H2): Si en el medio se forma alguno de estos gases, se observarán algunos cambios en el medio de cultivo:
- Aparición de burbujas.
- Fracturas en el agar.
- Desplazamiento del medio de cultivo hacia la boca del mismo debido a una producción intensa de gas.

ü Observación de la producción de Sulfhídrico (SH2). Para que se produzca el SH2
§ Las condiciones han de ser ácidas
§ Se necesita una fuente que suministre el azufre (Tiosulfato de Sodio)
§ Se necesita un indicador que nos permita visualizarlo (Sal de hierro® Citrato Férrico Amoniacal). Este indicador hace que el SH2 precipite en forma de un precipitado negro. Si la cantidad precipitada es pequeña, el precipitado se observará en la superficie del medio de cultivo. Si, por el contrario, la producción de SH2 es muy intensa, toda la parte profunda del tubo se verá negra. Ahora bien, si todo el fondo se ve negro ¿cómo sabremos el viraje del medio?. Pues bien, como para que se pueda producir el Sulfhídrico es necesario que se den unas condiciones ácidas, deberemos suponer que el medio de cultivo habrá virado a amarillo en el fondo. En la superficie si podremos diferencias entre el rojo y el amarillo sin ningún problema.
Prueba de la Catalasa
Definición: Es una enzima que se encuentra en la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas (a excepción del Estreptococcus, por eso es una prueba que nos permite diferenciar entre Estafilococos y Estreptococos).
Función: Descompone el peróxido de hidrógeno (H2O2 o agua oxigenada) que se forma como producto terminal oxidativo de la descomposición aeróbica de los azúcares:
2 H2O2 ¾¾¾¾¾® 2 H2O + O2 (gas)
catalasa
Técnica: Consiste en recoger con el asa de siembra una colonia procedente de un cultivo puro, reciente y colocarla sobre un portaobjetos. A continuación agregamos 1 gota de peróxido de hidrógeno al 30%(comercial) sobre el microorganismo con una pipeta Pasteur (no es necesario homogeneizar).
Resultados:
Si la prueba es POSITIVA: se formarán inmediatamente burbujas bien visibles.
Si la prueba es NEGATIVA: no se observará burbujeo.
Precauciones: es importante que la muestra no tenga su origen en un medio que contenga sangre, ya que podríamos obtener falsos positivos.
Prueba de la Oxidasa o Citocromooxidasa
Principio: se basa en determinar la presencia de las enzimas oxidasas, las cuales catalizan la transferencia de electrones desde el sustrato, que es generalmente orgánico, hasta el oxígeno.
Técnica: Se realizará según las instrucciones de la casa que nos proporcione el producto. Generalmente, en las oxidasas positivas, se produce una reacción entre la enzima y un sustrato que está en la tira reactiva dando lugar a un producto coloreado que suele ser el "azul de indofenol". El reactivo puede variar de una casa comercial a otra, así una prueba oxidasa+ se observará de un color que oscila entre el púrpura y el negro.
Precauciones: No tomar la muestra de medios coloreados.
Prueba del Indol
Principio: se basa en determinar la capacidad de un microorganismo para desdoblar el indol de la molécula de triptófano, que es un aminoácido, que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar metabolitos indólicos. A este grupo de enzimas, capaces de desdoblar el triptófano se les denomina "triptofanasas".
Técnica: Se utiliza un caldo de triptona o de peptona (a veces también se utiliza un medio semisólido: medio de S.I.M = Sulfhídrico; Indol; Movilidad). Se disponen 5 mL del medio en cada uno de los tubos que vayamos a utilizar para la prueba, esterilizamos, inoculamos e incubamos (35-37ºC / 24h). Por último, para saber si se ha producido el Indol añadimos 5 gotas del reactivo de "Kovacs indol".
Resultados:
Si la prueba es POSITIVA: aparece un anillo rojo en la superficie del medio.
Si la prueba es NEGATIVA: permanece un color amarillo, que es el color del reactivo (el reactivo es un aldehído)
Prueba del Citrato
Principio: consiste en determinar si una bacteria es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono alcalinizando el medio de cultivo. El medio de cultivo utilizado para observar la fermentación de citrato contiene también sales de amonio inorgánicas. Un organismo que es capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono, utiliza también las sales de amonio como única fuente de nitrógeno. Estas sales de amonio se van a desdoblar en amoniaco produciendo la consiguiente alcalinidad. El medio utilizado es el Agar Citrato de Simmons" que lleva como indicador el azul de bromotimol (cuando el pH es alcalino vira a azul intenso, mientras que el medio sin inocular tiene un color verde).
Técnica: Se utiliza un tubo inclinado. Hacemos la estría en superficie con un inóculo poco denso y lo llevamos a incubar (35-37ºC / 24h)
Resultados:
Si la prueba es POSITIVA: En la superficie del medio de cultivo se observa un viraje del verde a azul intenso.
Si la prueba es NEGATIVA: no se produce viraje, se queda verde.
Prueba del Rojo Metilo-Voges Proskauer (RM-VP)
INTRODUCCIÓN: Para el metabolismo de los Hidratos de Carbono se pueden dar varios procesos:
Glucólisis: proceso de hidrólisis por el cual se transforma la glucosa en ácido pirúvico.
Vías alternativas
- Pentosas fosfato: se puede usar al mismo tiempo que la Glucólisis o de forma independiente.
- Entner Douduroff: la utilizan algunas Enterobacterias sin necesidad de utilizar la Glucólisis y la vía de las pentosas fosfato.

El ácido pirúvico puede usarse mediante:
Ø Vía aeróbica: Respiración.
§ El aceptor final de electrones es una molécula inorgánica (O2).
§ Como productos obtenemos CO2 y H2O
§ Empoacetilo + CoA ® ciclo de Krebs + cadena transportadora de e-
Ø Vía anaerobia: Fermentación.
§ El aceptor final de electrones es una molécula orgánica.
§ Es de menor rendimiento energético que la Glucólisis.
§ Puede ser de tres tipos:
ü Láctica
ü Alcohólica
ü Ácido mixta o del Grupo Califorme: tiene como productos:
- Ácidos mixtos: fórmico, acético, succínico, etílico... (RM+)
- Butilenglicol ó Butanediol ® Acetoína (RM-)
Rojo de metilo (RM)
Principio: Es una prueba que mide de forma cualitativa los productos ácidos que se originan por el metabolismo de la Glucosa de forma que, cuando estos ácidos se producen en cantidad elevada, consiguen superar el sistema amortiguador llevando el pH del medio hasta 4 - 4,5.
Técnica: Se siembra 1 tubo para la prueba RM y otro para la de VP para cada muestra. Se incuba a 30-37ºC durante 48 horas a 4 días ó incluso 6 días, y finalizado el período de incubación le añadimos al tubo del RM 0,1-0,2 mL del reactivo Rojo de Metilo.
Resultados:
Si la prueba es POSITIVA aparece coloración roja en la superficie de contacto del reactivo y del medio de cultivo.
Si la prueba es NEGATIVA se queda el color del medio (amarillo)
Precauciones:
Es importante incubar como mínimo 48 horas. Si se observa un color anaranjado hay que continuar con la incubación hasta 4 días.
Si hacemos la lectura antes de las 48 horas todas las enterobacterias darán la prueba positiva, ya que todas fermentan la glucosa.
Las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo positivas producen como consecuencia del metabolismo de la glucosa unos productos ácidos en gran cantidad y estables. Trascurridas las 48 horas se añade el indicador. En este caso, los ácidos habrán superado el sistema amortiguador del tampón (pH = 4 – 4,5), por el contrario, las enterobacterias que van a ser Rojo de Metilo negativas también producen ácidos pero se producen en menor cantidad, son menos estables, se produce mayor cantidad de CO2 y, además, se producen productos como consecuencia de la degradación de las peptonas, con lo que el pH tiende a la neutralidad, es decir que tiende a alcalinizarse.

Voges-Proskauer
Principio: Es una prueba que pone de manifiesto un producto final neutro que es la Acetoína.
Técnica: Se inocula y se incuba durante 24 - 48 horas. Para poner de manifiesto la acetoína se utilizan 0,6 mL de a-naftol al 5% (intensifica el color) y 0,2 mL de KOH ó NaOH al 40% (oxida la acetoína en diacetilo, que es el producto coloreado junto con el alcali y las peptonas). Es importante que se añadan en este orden y tienen que ser medidas exactas.
Resultados: Se realiza la lectura a los 10-15 min de la adición de los reactivos:
Si la prueba es POSITIVA se observa un color rojo rosado en la superficie del medio.
Si la prueba es NEGATIVA se observa un color amarillo en la superficie del medio
Precauciones:
Después de la incubación del reactivo es importante dejar destapado el tubo con el fin de que el O2 se ponga en contacto con los productos formados, de tal forma que se acelere la reacción.
En la mayoría de los casos, las enterobacterias que son RM+ son PV- y viceversa.
O.N.P.G ortonitrofenol b-D-galactopiranósido
Principio: Es una prueba que pone de manifiesto la capacidad de un m.o de fermentar la Lactosa, demostrando la presencia ó ausencia de la enzima b-galactosidasa cuando se emplea un compuesto orgánico que es el ONPG. Si en la célula bacteriana se encuentran enzimas para metabolizar la lactosa, el reactivo ONPG es hidrolizado, liberando un compuesto amarillo (ortonitrofenol).
Estas enzimas son "inducidas" y están controladas genéticamente. Pueden disminuir o desaparecer después de varias generaciones si el sustrato no está presente.
NOTA: las enzimas "inducidas" son aquellas que la bacteria produce exclusivamente cuando se encuentra el sustrato sobre el que se va a ejercer su acción. Las enzimas "constitutivas" son aquellas que son producidas por la bacteria independientemente de que el sustrato se encuentre o no en el medio de cultivo.
Para que se produzca la fermentación de la Lactosa, un microorganismo necesita 2 enzimas:
b - galactosidasa permeasa: Se encuentra en la membrana celular. Transporta la Lactosa al interior celular.
b -D- galactosidasa: Hidroliza la Lactosa en el interior celular.
En función de que la bacteria tenga una, las dos o ninguna de las enzimas, podemos clasificarlas en:
v Activas: Poseen las dos enzimas.
v Retardadas: Carecen de la b-galactosidasa permeasa y poseen la b-D-galactosidasa. Tardan más tiempo en degradas la Lactosa porque tienen que producir la permeasa.
v No fermentadores: No poseen ninguna de las enzimas.
Técnica: Es necesario partir de un cultivo puro, reciente, preferiblemente obtenido a partir de un medio de cultivo de Kligler. Tomaremos una cantidad espesa de inóculo para demostrar rápidamente la presencia de la enzima.
A partir del cultivo preparamos una suspensión del microorganismo en un tubo de hemólisis con 0,5 mL de agua destilada. Ponemos un disco de ONPG en el tubo y lo incubamos a 37ºC.
Resultados:
Si la prueba es POSITIVA: en los 15-30 minutos posteriores a la adición del disco, el medio se habrá vuelto amarillo.
Si la prueba es NEGATIVA: habrá que esperar entre 2,3 o incluso 24 horas para una buena confirmación. El medio no cambiará de color.
Prueba de las Descarboxilasas
Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad que tiene un microorganismo, mediante la enzima correspondiente, para decarboxilar un aminoácido (Lisina, Arginina, Ornitina). Son enzimas inducidas y, generalmente, estas reacciones se producen en condiciones anaerobias. Son capaces de actuar sobre distintos aminoácidos, la enzima ataca al grupo carboxilo (-COOH) y da lugar a una amina y a CO2.
Nosotros sólo realizaremos la prueba de la Lisina Carboxilasa. Si esta enzima se encuentra presente se formará Cadaverina y CO2 (alcaliniza).
Dependiendo del medio de cultivo que se utilice, una vez inoculado, es necesario sellarlo para obtener las condiciones anaerobias. En este caso del caldo de Lisina no es necesario sellarlo, basta un tapón metálico, preferiblemente de rosca.
Técnica: Inoculamos el medio de cultivo (caldo) con un inóculo escaso y lo incubamos durante 24 horas a 37ºC. En algunos casos es necesario incubar hasta 4 días.
Resultados: El medio sin inocular es de color púrpura y suele contener glucosa y el aminoácido que queremos estudiar.
Si la prueba es POSITIVA: el medio tomará un color púrpura amarillento o púrpura turbio. Primero habrá pasado por el color amarillo y luego habrá revirado al púrpura.
Si la prueba es NEGATIVA: el medio tomara un color amarillo brillante. Solo se consume la glucosa.
Precauciones: Es conveniente guardar un tubo sin inocular con el fin de comprobar los resultados.
Prueba de la Ureasa
Principio: Con esta prueba ponemos de manifiesto la capacidad orgánica de algunas bacterias de desdoblar la urea en dos moléculas de amoníaco, mediante la acción de la enzima "Ureasa", que es una enzima constitutiva.
Técnica: Se pueden utilizar distintos medios de cultivo:
Agar base de urea: tiene el inconveniente que hay que prepararlo, esterilizarlo y, antes de que se enfríe, hay que añadirle la urea. Se usa de forma inclinada.
Caldo de urea: ya lleva incorporada la urea. Directamente se siembra el microorganismo y se incuba.
Resultados: Se observa a las 24 o incluso a las 48 horas.
· Si la prueba es POSITIVA: el medio se observará de un color rosado
· Si la prueba es NEGATIVA: no se producirá ningún cambio de color. Se mantendrá el color amarillo-anaranjado del medio inicial.
Prueba de la Fenilalanina Desaminasa
Principio: La prueba pone de manifiesto la capacidad enzimática de un microorganismo para desaminar la fenilalanina, originándose el ácido fenilpirúvico.
Técnica: Se utiliza el medio fenilalanina en tubo inclinado. Se siembra un inóculo denso, reciente, puro y se incuba durante 24 horas.
Resultados: Para poner de manifiesto el producto coloreado se añade Cloruro Férrico al 10% : Ác. Fenilpirúvico + Cloruro Férrico ® COLOR
Dejamos resbalar por la superficie del agar inclinado 5-6 gotas del reactivo y se mueve el tubo suavemente para extenderlo.
Si la prueba es POSITIVA: aparece un color verde sobre la superficie.
Si la prueba es NEGATIVA: se queda del color del Cloruro Férrico, es decir, amarillo.
SISTEMAS COMERCIALES DE IDENTIFICACIÓN
API 10 S: La galería API 10 S consta de 10 microtúbulos que contienen sustratos deshidratados. Estos test se inoculan con una suspensión bacteriana que reconstituye los medios. Durante la incubación, se producen cambios de color espontáneos o revelados por adición de reactivos. Después de la incubación de 18-24 horas a 35-37ºC, la lectura de reacciones se realiza visualmente con la Tabla de Lectura y la identificación se alcanza consultando la lista de perfiles de la ficha técnica o con un software de identificación.
Técnica:
Preparación de la galería: Repartir aproximadamente 3 mL de agua destilada en los alveolos del fondo de la cámara de incubación con el fin de crear una atmósfera húmeda. Inscribir la referencia de la cepa en la lengüeta lateral de la cámara
Preparación del Inóculo: Preparar una suspensión de una colonia del m.o con 5mL de solución fisiológica al 0,85%.



Inoculación de la galería:
- Llenar el tubo y la cúpula del test ½CIT½con la suspensión bacteriana.
- Llenar solo los tubos (y no las cúpulas) de los otros test.
- Crear una anaerobiosis en los test LDC, ODC, H2S, URE, llenando su cúpula con aceite de parafina.
- Cerrar la cámara de incubación
- Incubar a 35-37ºC durante 18-24 horas.
Lectura de la galería: se utiliza la Tabla de Lectura. Anotar las reacciones espontáneas en la hoja de resultados y luego leer los test que requieren añadir reactivos:
Test TDA: añadir 1 gota de cloruro Férrico. Una coloración marrón-rojiza indica una reacción positiva.
Test IND: añadir 1 gota de reactivo de Kovacs. Si la reacción es positiva aparecerá una coloración rosa.
Test NO2: añadir 1 gota de reactivos NIT1 y NIT2 en el tubo GLU. Esperar de 2 a 5 minutos. Una coloración roja indica una reacción positiva.
Identificación: se realiza mediante un perfil numérico. En la hoja de resultados, los test están separados en grupos de tres y un valor 1, 2 ó 4 se indica para cada uno. Dado que la galería API 10 S consta de 1º test, al sumar los valores dentro de cada grupo que corresponden a las reacciones positivas, se obtienen 4 cifras que corresponden al perfil numérico.
"Enterotube": Se utiliza para la identificación de Enterobacteriaceae.
Técnica:
Quitar los capuchones de protección roscados. Bajo el capuchón blanco se encuentra la punta de la aguja de inoculación. Con la punta de la aguja sin flamear se pica ahora cuidadosamente una colonia bien aislada, sin atravesar el agar.
Extraer la aguja por todos los compartimentos, haciéndola girar ligeramente. Seguidamente se introduce de nuevo la aguja hasta que la muesca de la aguja alcance la abertura del tubo. La punta de la aguja debe llegar hasta el compartimento de citrato.
Romper la aguja, doblándola hacia un lado, por la muesca. Con el extremo restante de la aguja rota se perfora ahora la película plástica que recubre los orificios de aireación de los últimos 8 compartimentos para así permitir en estos un crecimiento en aerobiosis. A continuación, enroscar de nuevo los capuchones.
Incubar en posición vertical, con el compartimiento de glucosa hacia arriba, o bien en posición horizontal, con la película de plástico hacia abajo a un temperatura de entre 35-37ºC durante 20-24 horas.
Después de la incubación se registran, en una ficha de interpretación, las reacciones positivas, a excepción de los compartimentos del Indol y VP, ya que necesitan la adición de reactivos. Para la prueba del Indol añadir con una jeringa 3 ó 4 gotas de reactivo de Kovacs, atravesando la superficie de plástico por arriba del compartimiento de H2S / Indol. Será positivo si el reactivo agregado adquiere un color rojo en pocos segundos. Para la prueba de VP inyectar 3 gotas de solución a-naftol y 2 gotas de KOH por el orificio de aireación lateral en el compartimiento de VP con el Enterotube en posición horizontal. Será positivo si el reactivo agregado adquiere un color rojo dentro de los 10 minutos siguientes.
IDENTIFICACIÓN SERÓLOGICA
Se utiliza fundamentalmente para la identificación del género Salmonella, Shigella y E.coli.
Se basa en la utilización de pruebas de aglutinación mediante la identificación de al menos tres antígenos. Estos antígenos son:
Ag somático 0: Lo suelen poseer cepas como:
· E.coli 0112: es una cepa enteroinvasiva que produce un cuadro de diarrea similar a la originada por Shigella.
· E.coli 0157: produce una neurotoxina que da lugar a una colitis hemorrágica y al síndrome urémico hemolítico.
· Shigella: permite clasificar en cuatro grupos diferentes la identificación de este Ag somático 0.
Ag capsular K: Está constituido por polisacáridos de la cápsula. Es termolábil. Suele estar presente en los géneros Klebsiella, Salmonella (algunas cepas pueden presentar un Ag Vi que está relacionado con la mayor virulencia de las mismas) y E.coli.
Ag flagelar H: Está formado por proteína. Son termolábiles.
DIAGNÓSTICO INMUNOLÓGICO
Ø PATOLOGÍAS
ENTEROBACTERIAS ASOCIADAS CON INFECCIONES GASTROINTESTINALES Y FIEBRE ENTÉRICA
"Escherichia coli": Es una bacteria que se asocia con 4 tipos distintos de infección entérica:
E.coli enterotoxigénica (ETEC)
Esta es la que se asocia en mayor grado con las diarreas infantiles en los países subdesarrollados y es causante también de la diarrea del viajero. Generalmente, este tipo de diarreas se produce como consecuencia de la ingestión de agua y alimentos contaminados. Para que se produzca el cuadro diarreico es necesario que se ingiera una elevada cantidad de m.o ya que estos no suelen resistir la acción de pH ácido del estómago.
El m.o coloniza el intestino delgado favoreciendo la adhesión mediante las fimbrias que posee, además produce 2 tipos de toxinas: una termolábil y otra termoestable. Estas toxinas inducen una secreción activa de metabolitos a la luz intestinal y el cuadro clínico se manifiesta como diarrea acuosa, nauseas, dolor abdominal y fiebre.
E.coli enteroinvasiva (EIEC)
Estas cepas de E.coli dan lugar a un cuadro similar a la Shigellosis. Son capaces de invadir y multiplicarse en las células epiteliales de la mucosa intestinal, produce fiebre, dolor abdominal y diarrea acuosa con eliminación de sangre y moco. En ocasiones puede producir un cuadro de toxemia.
E.coli enteropatógena (EPC)
Estas cepas de E.coli pueden dañar la mucosa intestinal originando descamación de la misma. Algunas cepas producen toxinas que tienen una acción citotóxica.
El cuadro clínico se presenta con diarrea, eliminación de moco y apenas presencia de sangre. Suelen afectar con mayor frecuencia a los lactantes y a niños de corta edad.
E.coli 0157: H7
Suele producir dos cuadros clínicos:
Colitis hemorrágica. Es una forma grave de diarrea.
Síndrome urémico hemolítico. Se produce una insuficiencia renal, anemia hemolítica y trombocitopenia.
"Salmonella": Produce gastroenteritis transmitidas generalmente por el consumo de alimentos contaminados por el m.o. Es móvil.
El reservorio de la Salmonella suele ser los animales, excepto la Salmonella typhi cuyo reservorio es el hombre.
Los puentes de las infecciones por Salmonella suelen ser las aves y sus productos, y con menor frecuencia, leche y sus derivados.
Para que se produzcan los cuadros de gastroenteritis es necesaria la ingestión de un gran número de m.o ya que la acidez gástrica disminuye el número de m.o viables. Aquellos que sobreviven a la acidez gástrica pasan al intestino delgado donde se multiplican. Esta proliferación del m.o en el intestino puede cursar sin sintomatología clínica o de forma sintomática. En éste último caso, se puede manifestar como enterocolitis, bacteriemia o fiebre entérica:
Fiebre Entérica: El cuadro de esta fiebre suele estar producido por S. typhi o por S. paratuphi. Da lugar a lo que se conoce como fiebres tifoideas o paratifoideas.
Una vez que se produce la ingestión de estas salmonellas y llegan al intestino delgado, pueden atravesar el sistema linfático y alcanzar el torrente circulatorio produciéndose la diseminación a otros órganos.
Bacteriemia: Suele estar producida por S.cholerae, S.suis y otros tipos de Salmonella.
Enterocolitis: Suelen estar causadas por S. typhimurium que es la forma más común de manifestarse las infecciones por Salmonella.
Este tipo de infecciones producidas por S. typhimurium, después de transcurridas de 8 a 48 horas de la ingestión de alimentos contaminados se produce un cuadro de nauseas, vómitos y diarrea. La que más importancia tiene en el cuadro clínico de las Salmonellas es la Enterocolitis, porque se produce por la ingestión de alimentos. No citan tratamiento antibiótico.
"Shigella": Son una de las causas más frecuentes de diarrea bacteriana. La diarrea producida por Shigella también se conoce como disentería bacilar.
La vía de transmisión de este microorganismo es la vía fecal-oral y también a través de los alimentos contaminados con heces. Resiste la acidez gástrica, por lo que es suficiente un pequeño número de m.o para producir la infección. Se multiplica en la mucosa intestinal aunque sin llegar a atravesarla, por este motivo, los hemocultivos serán negativos.
Shigella dysenteride tipo I
Elabora una toxina termolábil que es neurotóxica y citotóxica. Produce una diarrea similar a la enterotoxina termolábil de E.coli. El carácter neurotóxico de la toxina determina que, en ocasiones, se puedan producir cuadros de meningitis y coma. Generalmente, los niños de corta edad son los más afectados por este tipo de infección.
"Yersinia": Dentro de este género, la Yersinia enterocolítica, da lugar a cuadros de gastroenteritis por ingestión de agua o alimentos contaminados. Con menor frecuencia, también se produce la infección por contacto directo con animales infectados. Este m.o es capaz de crecer a temperaturas de refrigeración, por lo que es un m.o a tener en cuenta en la industria alimentaria. Para que se produzca la infección es necesario que el sujeto ingiera gran cantidad de inóculo.
Con menor frecuencia se aíslan también Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia intermedia, que también originan cuadros de gastroenteritis.
ENTEROBACTERIAS ASOCIADAS CON INFECCIONES EXTRAINTESTINALES
"Yersinia pestis": Es el agente etiológico de la peste bubónica. Se transmite por la picadura de la pulga o por manipulación de animales infectados. El principal reservorio lo constituyen las ratas.
Una vez que el m.o penetra a través de la piel, como consecuencia de la picadura, es fagocitado por macrófagos y leucocitos en cuyo interior se multiplican. Durante esta fase intercelular el m.o sintetiza dos Ag, uno proteico y otro lipoproteico, que permiten que el m.o no sea destruido por las células inmunitarias una vez que se produce la lisis de la célula que parasita.
Las infecciones por Yersinia pestis se pueden manifestar como peste bubónica, peste sistémica o peste neumónica.
En la peste bubónica hay una infección de los ganglios linfáticos con inflamación, pudiendo producirse cuadros de neumonía por diseminación hematógena. La peste sistémica se caracteriza por fiebre y bacteriemia. La peste neumónica es muy contagiosa por vía aérea.

"E.coli": Es la principal causa de infecciones del tracto urinario. Pueden dar lugar a cuadros de cistitis, uretritis, pielonefritis y sepsis.
Las cepas implicadas en este tipo de infecciones son las denominadas Urohepatogénicas, debido a que poseen elementos de adherencia entre otros factores de patogenicidad.
El E.coli también produce infecciones de tipo nosocomial, entre las que se encuentran neumonías e infecciones de heridas quirúrgicas.
Además puede producir meningitis neonatal, que está producida por una cepa con Ag capsular denominada K1.
"Klebsiella"-"Enterobacter"-"Serratia": Este grupo de enterobacterias da lugar a infecciones de origen nosocomial.
Klebsiella pneumoniae. Es el agente etiológico de aproximadamente el 3% de las neumonías de origen bacteriano. Suele afectar a individuos con diabetes, alcoholismo o infecciones pulmonares. (inmóvil)
El género Enterobacter engloba patógenos oportunistas que producen principalmente infecciones de heridas, quemaduras e infecciones de tracto respiratorio y urinario.
Serratia es un género formado por especies habitualmente saprofitas del suelo que pueden producir infecciones nosocomiales, principalmente del tracto respiratorio y urinario.
"Proteus"-"Morganella"-"Providencia": Estos géneros se suelen relacionar con infecciones del tracto urinario. La capacidad que tienen para hidrolizar la orina produce la liberación de amoníaco, lo que determina una alcalinización de la misma que induce a la formación de cálculos. Por otro lado, la movilidad del género Proteus favorece la invasividad del tracto urinario por parte de esta enterobacteria. El género Providencia se ha asociado a bacteriemias en pacientes con catéteres venosos.
"Citrobacter": Esta bacteria se engloba dentro del género de patógenos oportunistas. Se asocia con infecciones urinarias y respiratorias en pacientes hospitalizados. (móvil).
El Citrobacter diversus se asocia en casos de meningitis en neonatos.

GÉNERO I: VIBRIO
Son bacilos Gram-, anaerobios facultativos, móviles (flagelo polar), Oxidasa+, reducen los nitratos a nitritos, todos los miembros de este género son capaces de crecer en medios que contienen sal (halofílicos).
El género Vibrio está ampliamente distribuido en la naturaleza. Son bacterias acuáticas. Ciertas especies de Vibrios producen infecciones localizadas y otras especies pueden dar lugar también a infecciones sistémicas.
Ø ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
Poseen el antígeno flagelar H, que es termolábil y el antígeno somático O, que es termoestable, de naturaleza polisacárida, específicos y que se utilizan para la serotipificación.
Vibrio cholerae 01
Son los que producen las epidemias de cólera. Estas cepas epidémicas de V.cholerae se pueden separar según factores específicos en los serotipos: Ogawa ; Inaba y Hikojima. Además de estos serotipos, se conocen también dos biotipos de V.cholerae 01 que son el Clásico y El Tor.
Ø TOXINAS
El V.cholerae produce una potente enterotoxina que provoca un aumento de la secreción de agua y electrolitos a la luz intestinal.
El biotipo El Tor de V.cholerae produce hemolisinas que son termolábiles y tienen una actividad citotóxica.
Otras especies de Vibrios producen toxinas extracelulares con actividad citolítica y citotóxica.
Ø AISLAMIENTO
Transporte de las muestras:
Para aquellas muestras que son extraintestinales, el procesamiento de las mismas se realiza de igual manera que para el aislamiento de otras bacterias.
Cuando la muestra son heces, y no se van a procesar inmediatamente después de su recogida, es necesario utilizar un medio de transporte (Ej. Cary-Blair) con el fin de evitar la exposición al aire de la muestra, ya que los Vibrios son muy sensibles a la desecación.
Medios de cultivo: Los Vibrios se desarrollan bien en:
· Agar sangre: los Vibrios desarrollan colonias con o sin hemólisis, Oxidasa+.
· Agar MacConkey: dan lugar a colonias incoloras, Lactosa-.
Cuando se sospecha una infección entérica por V.cholerae es necesario incluir una placa de un medio selectivo : Agar TCBS (Triptosa, Citrato, Bilis, Sacarosa). En este medio, los Vibrios que son fermentadores de sacarosa producen colonias amarillas, mientras que los no fermentadores dan lugar a colonias verde azuladas.
Cuando es necesario utilizar caldos de enriquecimiento para el aislamiento, a partir de las heces, es conveniente utilizar Agua de Peptona alcalina con un 1% de Cloruro Sódico.
Ø IDENTIFICACIÓN
· Tinción de Gram: son bacilos Gram-, cortos, rectos o curvados.
· Pruebas bioquímicas: se utilizan los medios habituales para la identificación de enterobacterias, siempre y cuando estén enriquecidos con Cloruro Sódico.
Ø PATOLOGÍA
ü Vibrio cholerae 01: Es el agente etiológico del Cólera. Tiene 2 biotipos el Clásico y El Tor.
El biotipo El Tor causa infecciones menos graves que el biotipo Clásico. La infección se adquiere por vía oral, se necesita una dosis de m.o alta y, una vez que han superado la mucosa gástrica, los Vibrios se fijan en las células epiteliales del intestino delgado donde elaboran la enterotoxina.
Los síntomas clínicos son nauseas, vómitos, dolor abdominal y diarrea acuosa. Las deposiciones son continuas, lo que conduce a una pérdida masiva de agua y electrolitos.
El tratamiento es fundamentalmente sintomático y consiste en la reposición de líquidos y electrolitos.
ü Vibrio cholerae NO 01: También producen cuadros de gastroenteritis, aunque más leves que el cólera y, en ocasiones también se aíslan en infecciones extraintestinales:
- Vibrio vulnificus: es el más patogénico.
- Vibrio parahaemolyticus: es junto con el V.cholerae el m.o que con más frecuencia se aísla en clínica. Se asocia con infecciones gastrointestinales por consumo de pescado crudo.
Ø EPIDEMIOLOGÍA Y CONTROL
Los factores de riesgo para la adquisición de infecciones por especies de Vibrios no coléricos son el consumo de pescado y mariscos crudos o poco cocinados y el contacto con heridas y mucosas con aguas contaminadas.
Por lo que respecta al Cólera, la diseminación del mismo se produce por contacto de persona a persona y por el consumo de alimentos y aguas contaminadas.
El control de las infecciones producidas por los Vibrios consiste en la educación sanitaria y en la mejora de las condiciones higiénico-sanitarias.
GENERO: AEROMONAS
Son bacilos Gram-, anaerobios facultativos, Oxidasa+, fermentan la Glucosa con o sin producción de gas, son móviles (flagelo polar), capaces de crecer en un amplio intervalo de temperaturas.
Se diferencian de los Vibrios porque no crecen en concentraciones al 6,5% de Cloruro Sódico. Habitan aguas dulces y saladas, sonde infectan a los peces y, en el hombre, se asocian a infecciones gastrointestinales.
PATOLOGÍA
Consiste en diarrea aguda (infección más frecuente producida por este tipo de microorganismo que se asocia a la diarrea del viajero). Con menos frecuencia puede dar lugar a celulitis e infecciones de heridas por contacto con agua o tierra contaminada.
GÉNERO : PLESIOMONAS
Este género comprende una única especie, P.shigelloides, que produce Catalasa y Oxidasa, fermenta la Glucosa sin producción de gas, es capaz de crecer en un amplio margen de temperaturas siendo la óptima 37ºC.
Generalmente habita en el intestino de peces de agua dulce y animales. Se asocia con infecciones intestinales en áreas tropicales y subtropicales.
MEDIOS DE CULTIVO. AISLAMIENTO
Se desarrollan en agar sangre y también en Agar Salmonella-Shigella.
Se distingue de las Enterobacterias por la prueba de la Oxidasa.
Se distingue de las Aeromonas por la prueba de la Dnasa (Aeromonas son +)
Se distingue de los Vibrios en que no toleran la sal (Vibrios sí).

GÉNERO : ESTAFILOCOCOS
Son Cocos Gram+, aerobios y anaerobios facultativos, inmóviles, Catalasa +, no esporulados, generalmente no capsulados y se agrupan en racimos u otras formas (parejas, tetradas,...). Resisten a la acción del calor, sales biliares, cloruro sódico 9,5% y a la optoquina.
El género Sataphylococcus se compone de 27 especies, la mayor parte de las cuales son flora habitual del hombre y se localizan preferentemente en la piel y en las mucosas.
De entre las especies de Staphylococcus, las que se asocian con más frecuencia a infecciones son S. aureus (Coagulasa+), S, epidérmidis (Coagulasa-) y S. saprophyticus (Coagulasa-).
Crecen bien en los medios habituales de laboratorio. Las muestras clínicas en las que se sospecha que pueden contener Staphylococcus se siembran en un medio general como el Agar Sangre y en un medio líquido como el Caldo de Tioglicolato o el Caldo de Infusión de Cerebro-Corazón.
S. aureus ® Colonias de color amarillo anaranjadas
S. epidermidis® Colonias blanco grisáceas
S. saprophyticus ® Colonias grandes, de aspecto brillante y opacas
AISLAMIENTO DE STAPHYLOCOCCUS DE MUESTRAS MUY CONTAMINADAS
Como muestras contaminadas se refiere por ejemplo a heces. Se utilizan medios selectivos:
Agar Sal y Manitol: S. aureus y saprophyticus ® acidifican el medio
Agar Sal lipasa-manitol: S. aureus ® zona amarilla alrededor de la colonia y una zona opaca por la precipitación de los lípidos.
Agar Columbia
Agar Alcohol-Feniletílico



IDENTIFICACIÓN
- Resiste a la Bacitracina: permite diferenciar entre Staphylococcus y Micrococos.
- Prueba de la Catalasa: permite diferenciar Staphylococcus de Streptococcus.
- Morfología de la colonia
- Fermentación de Carbohidratos
- Coagulasa
- Hemólisis
- Resistencia a la Novobiocina
- Actividad Fosfatasa
- Desoxirribonucleasa
- Ureasa
Prueba de la Coagulasa
S. aureus es capaz de producir una proteína llamada Coagulasa que es capaz de aglutinar el plasma en presencia de un factor contenido en el suero. Esta factor reacciona con la coagulasa, activa el fibrinógeno y produce un coágulo de fibrina. Esta coagulasa se puede encontrar de forma ligada o en forma libre.
El estudio de esta actividad coagulasa se puede llevar a cabo en tubo o en portaobjetos:
En Portaobjetos:
Poner una gota estéril de agua destilada o solución salina fisiológica sobre el porta.
Emulsionar suavemente con una suspensión espesa de Staphylococcus o una colonia tomada con un asa.
Mezclar suavemente la suspensión de Staphylococcus con el plasma que podamos tomar con un asa.
Observar la inmediata formación de un precipitado macroscópico.
Prueba Positiva Prueba Negativa
Acentuada aglutinación ® 5-20 sg No se observan cambios, la
Retardada ® 20 sg-1min suspensión permanece homogénea
Dudosa ® > 1min
En el caso de que la aglutinación sea dudosa, será necesario repetirla o realizar la prueba en tubo.
En tubo:
Poner en un tubo estéril de hemólisis 0,5 mL de plasma de conejo y 0,5 mL de un cultivo en caldo o placa. En este último caso se tomará un número suficiente de colonias.
Incubar en un baño a 37ºC durante 4 horas. Observar cada 30 min.
Prueba Positiva Prueba Negativa
Se forma un coágulo o filamentos de fibrina definidas Sin cambios
Completa: coágulo en todo el tubo
Parcial


Prueba de la Hemólisis
S. aureus ® halo translúcido
S. saprophyticus y S. epidermidis ® No tienen capacidad hemolítica
Resistencia a la Novobiocina
Solamente S. saprophyticus es resistente. Se utilizan discos
Actividad Fosfatasa
Algunas especies de S. aureus y S. epidermidis producen la Fosfata Alcalina. Esta enzima actúa sobre el Difosfato de Fenolftaleina y los transforma en Fenolftaleina libre. Esta Fenolftaleina libre, al reaccionar con un álcali da lugar a un color rojo rosado brillante.
Reactivos:
Sal Sódica Difosfato de Fenolftaleina al 0,5% en agua destilada. Debe estar esterilizado por filtro de membrana (0,22 mm como diámetro del poro)
Medios:
Caldo Nutritivo: 3 mL de caldo por tubo. Esterilizar y antes de enfriar añadir una gota de reactivo.
Agar Nutritivo
Método utilizando el caldo nutritivo:
Se inocularán 2 tubos rotulados como A y B con un inóculo denso de un cultivo puro y reciente (18-24 horas).
Incubar a 35ºC durante 6 horas. Transcurrido este tiempo añadir 1 gota de NaOH 10N al 40% al tubo A.
Si no hay viraje, lo desechamos y continuamos la incubación con el tubo B hasta 24 horas.
Método utilizando el agar nutritivo:
Esterilizamos el medio, lo dejamos enfriar y le añadimos 2 mL de fenolftaleina al 5% por cada 98 mL de medio. Lo mezclamos y plaqueamos.
Sembramos por estría con un inóculo poco denso, procedente de un cultivo puro y reciente e incubamos a 37ºC durante 24 horas.
Para proceder con la lectura es necesario exponer las colonias al vapor de amoniaco. Esto se puede hacer de dos formas:
Tras la incubación mantenemos las colonias sobre un frasco abierto
Agregar 1 mL de amoniaco a la tapa de la placa de petri donde hemos realizado la siembra e invertimos el cultivo sobre ella.
Se considerará resultado positivo si aparece un color rojo rosado brillante
Se considerará resultado negativo si no se observan cambios. Colonias claras o blancas.

Prueba de la Desoxirribonucleasa (DNAasa)
Se utiliza el Agar DNAasa. Sembramos con una estría única de aproximadamente 2 cm de longitud y se incuba a 37ºC durante 24 horas.
Después de incubar añadimos, inundando la placa, ClH 0,1 N que reacciona con el DNA presente apareciendo una zona turbia.
A los 5 minutos realizamos la lectura de los resultados:
Se considera prueba positiva si aparece una zona clara alrededor de la línea de siembra.
Se considera prueba negativa si aparece turbidez en toda la superficie del medio de cultivo.
En ocasiones este medio lleva indicadores que nos indican si el m.o posee la DNAasa sin necesidad de añadir el HCl. Estos indicadores pueden ser:
§ Verde de Metilo: prueba positiva ® halo claro / prueba negativa ® verde intenso
§ Azul de Toluidina: prueba positiva ® halo rosa / prueba negativa ® halo azul
(se puede añadir sobre el propio crecimiento)
Prueba de la Ureasa
Pruebas que ponen de manifiesto la producción de ácido por fermentación de carbohidratos
Utilización de Sistemas Comerciales de identificación: basados en pruebas bioquímicas, enzimáticas...(Ej. API)
ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
Puesto que Staphylococcus es una bacteria Gram+ tiene una estructura antigénica compleja y muy variada:
Peptidoglucano: es un polisacárido constituido por N-acetil murámico y N-acetil glucosamina. El peptidoglucano induce a la producción de Interleuquina I (*) y de Ac opsonizantes (*), además proporciona una actividad endotóxica.
Ácidos Teitoicos
Proteína A: se une a la región Fc (*) de la IgG y activa el complemento (*)
Factor de aglutinación: coagulasa unida (fijada) ® fija fibrinógeno
Polisacárido:
S. aureus ® cápsula polisacárida que inhibe la fagocitosis
S. epidermidis ® exopolisacárido (Slime) que permite la adherencia a superficies plásticas, además de contribuir a la resistencia a la fagocitosis por los polimorfonucleares.
ENZIMAS
Coagulasa, Hialuronidasa, b- Lactamasas, Nucleasas, Lipasas

TOXINAS
Alfa toxina: actúa sobre la membrana de los eritrocitos
Beta toxinas: degrada enfingomielina (*)
Gamma toxina: lisa eritrocitos
Delta toxina: ejerce una acción detergente sobre membranas biológicas
Toxina esfoliativa: produce daños dermatológicos (Síndrome piel escaldada)
Toxinas implicadas en el Síndrome del Shock Séptico
Enterotoxinas: termoestable, resiste la acción de las enzimas del tubo digestivo. Se producen cuando los Staphylococcus crecen en alimentos ricos en carbohidratos y proteínas.
PATOGENIA
S. aureus: 2-40% son portadores nasales y un 10% son mujeres (vagina)
Infecciones de la piel: forúnculos, ántrax, celulitis, impétigo...
Bacteriemias, endocarditis, meningitis, neumonía, osteomielitis...
Síndrome del Shock Tóxico (fiebre, hipotensión, afectación multisistémica)
Intoxicaciones alimentarias
S. coagulasa negativos:
S. epidermidis: bacteriemia, endocarditis infecciosa, peritonitis, osteomielitis, infección del tracto urinario, infección de catéteres y prótesis...
S. saprophyticus: infecciones del tracto urinario
S. haemolyticus; S. lugdunensis; S. schleiferi ® oportunistas
(*)Complemento: es un conjunto de 20 proteínas que dan lugar a un sistema enzimático en cascada en el plasma. Sus funciones son las siguientes:
Opsonización
Quimiotaxis
Aumento del flujo sanguíneo y permeabilidad capilar en infección (inflamación)
Lisis celular, bacterias y hongos
El complemento se puede activar por dos vías:
§ Vía Clásica: activada por la unión del Ag al Ac. Esta unión activa los siguientes escalones C1, C2...hasta llegar al C3.
§ Vía Alternativa: activada por los polisacáridos cuando la infección es producida por bacterias Gram+. Igual que la anterior finaliza en el C3.
A partir de la Fracción C3 se produce la activación de la C3a y C3b. C3a va activando consecutivamente otras fracciones dando lugar a la inflamación. Por su parte, C3b da lugar a la opsonización, relacionada con la quimiotaxis.


(*) Estructura de las Ig:
(*) Opsonización: Es el proceso por el cual las bacterias se hacen atractivas a los fagocitos. El germen se une a la IgG y C3b (proteínas plasmáticas) y de esta forma el microorganismo se hace más fácilmente reconocible por los fagocitos (se modifica la estructura fisiológica de la bacteria).
(*) Linfoquinas: son proteínas liberadas por los linfocitos TD.
Factor quimiotáctico
Factor inhibidor de la migración de los macrófagos
Factor activador de macrófagos
Interleuquina I: promueve la activación y multiplicación de los linfocitos B y T. El Ag estimula a la célula presentadora de Ag y ésta secreta Interleuquina I que activa los linfocitos T (fabrican la Interleuquina II)
Interleuquina II Interferol
(*) Esfingomielina: La esfingomielina está constituida por esfingosina (forma parte de los cerebrósidos), ácido fosfórico, ácidos grasos, colina (transporte de grasas) y se localiza en grandes cantidades en el cerebro y en el tejido nervioso. Es degradada por las toxinas b de los Estafilococos.

GÉNERO : STREPTOCOCCUS
Los Estreptococos son cocos Gram+ (en cultivos viejos pueden perder su carácter Gram+), inmóviles, Oxidasa y Catalasa – que se observan al microscopio en parejas o en cadenas de diferente longitud. Las células aisladas tienen forma esférica u ovoide. Cuando se presentan en parejas pueden tener aspecto de bacilo.
Son m.o anaerobios facultativos, aunque hay cepas que crecen mejor en condiciones microaerofílicas.
Las pruebas de la Catalasa y de la Oxidasa les diferencian de los cocos Gram- de género Neisseria que son positivos para estas pruebas.
Los Estreptococos son m.o que están ampliamente distribuidos en la naturaleza, algunos de ellos son flora habitual del hombre y otros se asocian a infecciones bien por acción directa o por fenómenos de sensibilización.
La clasificación de los Estreptococos resulta compleja por lo cual se recurre a una combinación de factores morfológicos, bioquímicos y serológicos.
ESTRUCTURA ANTIGÉNICA
Ag de la pared: es específico de grupo y se denomina "carbohidrato C". Está localizado en la pared celular lo que permite clasificarlos serológicamente en los llamados "grupos de Lancefield".
Proteína M: se trata de un Ag proteico que se encuentra en la pared celular y constituye el principal factor de virulencia del Strept. pyogenes que es un Estreptococo perteneciente al grupo A.
Esta proteína se encuentra en unas proyecciones similares a las fimbrias que sobresalen de la pared celular. Su presencia o ausencia condiciona la virulencia de la cepa. En el caso de que en el huésped no existan Ac frente a esta proteína, las cepas de S. pyogenes con dicha proteína son capaces de resistir la acción fagocítica de los leucocitos. Además, esta proteína también está implicada en los procesos de adherencia a células epiteliales.
Otros Ag:
- Proteína T y R: se encuentran en la pared celular.
- Nucleoproteínas
- Cápsula polisacárida (S. pneumoniae)
TOXINAS Y ENZIMAS
Streptocinasa o Fibrinolisina: la poseen los Strept. b hemolíticos del grupo A
Streptodornasa o Desoxirribonucleasa Estreptococica.
Hialuronidasa
Toxina eritrogénica: produce lesiones cutáneas propias de la escarlatina.
Hemolisina: b hemólisis-completa / a hemólisis-incompleta
Estreptolisina (S. pyogenes): tipo 0 / Tipo S
AISLAMIENTO
Medios Generales que contengan sangre o derivados:
Agar Columbia
Agar Tripticasa Soja con un 5% de sangre de carnero
Agar Chocolate
Medios de Enriquecimiento
Caldo Tripticasa Soja
Caldo Todd-Hewit
Medios Selectivos
Agar Columbia suplementado con Colistina-Nalidíxico
Agar feniletílico
Medios Selectivos de Enriquecimiento
1 Medio de Todd-Hewit modificado. Posee Azida Sódica (inhibe la presencia de Gram-) y Cristal Violeta (inhibe los posibles Stafilococcus de la muestra).


IDENTIFICACIÓN: Pruebas Bioquímicas
§ Sensibilidad a la bacitrocina (Streptococcus del grupo A)
§ VP
§ Hidrólisis del Hipurato: pone de manifiesto si el Estreptococo tiene una enzima que actúa sobre el Hipurato que es la "hipurinasa". Se revela con un reactivo. Esta prueba sirve para Strep. del grupo B, cepas del grupo D y algunos a hemolíticos.
§ Tolerancia a la sal: diferenciamos a los Enterococos de los b hemolíticos A, C, F, G y del S. viridans porque los Enterococos toleran la sal (alto contenido salino: 6,5).
§ Prueba de la Bilis Esculina: los Strept. del grupo D hidrolizan la esculina en presencia de bilis dando como productos esculetina y glucosa.
El medio que se usa es el Medio Bilis Esculina que es sólido y se deja enfriar inclinado. La siembra se realiza a partir de un caldo, depositando dos gotas con una pipeta o un asa. La incubación se hace a 35-37ºC durante 48-72 horas.
Si la prueba resulta positiva se observa un color negro en la mitad o más de la superficie.
Si la prueba resulta negativa no hay ennegrecimiento o aparece en menos de la mitad del medio.
§ Solubilidad en Bilis: esta prueba se usa para diferenciar neumococos de otros Strept. del grupo viridans. La bilis lisa las células de S. pneumoniae y, por el contrario, no es capaz de solubilizar las células de otros Strept. de ese grupo viridans.
§ Sensibilidad a la Optoquina: esta prueba nos permite diferenciar entre neumococos, que son sensibles a la optoquina, y Strept. hemolíticos, que son resistentes. Se realiza de forma similar a la de la bacitrocina.
§ Utilización de Carbohidratos.
§ Prueba de CAMP: sembramos en una placa de Agar Sangre estreptococos de forma perpendicular y sin tocarse a una siembra de S. aureus. Si el m.o se trata de un Strept. del grupo B se producirá una sustancia llamada CAMP que en presencia de los Estafilococos producen una zona de lisis en forma de punta, agrandando la zona de hemólisis.

Ejercicio: Hacemos un urocultivo. Sembramos un agar sangre y un agar MacConkey. Las posibles opciones son las siguientes:
No hay colonias
Agar sangre Crecen colonias iguales
Crecen colonias distintas
Agar MacConkey Crecimiento
No crecimiento

PATOLOGÍA
Ag específico de grupo (c): nos permite la clasificación de los Estreptococos b-hemolíticos. Es un carbohidrato.
Proteína M: la posee el S. pyogenes el grupo A
b- Hemolíticos (S. pyogenes del grupo A)
Las infecciones producidas por S. pyogenes se pueden clasificar en tres grandes grupos:
Enfermedades por invasión de tejidos:
- Erisipela: inflamación aguda de la piel con afectación de los vasos linfáticos cutáneos que cursa con fiebre elevada y escalofríos. El área afectada suele ser la cara y, en ocasiones, el tronco y las extremidades.
- Fiebre puerperal y sepsis: comienza como una infección del útero como consecuencia de un parto o de un aborto y puede evolucionar desde la infección uterina hasta una peritonitis produciendo en algunos casos cuadros de septicemia.
Enfermedades por infección localizada producida por S. pyogenes y sus productos:
Faringitis: aparece inflamación, fiebre, afectación de los ganglios linfáticos del cuello. Se da un elevado porcentaje de portadores asintomáticos. El tratamiento es importante para prevenir posibles complicaciones como la fiebre reumática y la glomerulonefritis.
Fiebre Escarlatina: se produce en aquellos casos en los que las cepas de S. pyogenes producen una toxina eritrogénica que afecta a pacientes que no están inmunizados. Se caracteriza por inflamación de tejidos que pueden llegar a formar abscesos localizados generalmente en las anginas y que pueden llegar a bloquear el paso del aire. Se observa también un exantema de color rosado que se acompaña de fiebre.
Pioderma (impétigo): vesículas rellenas de un líquido purulento son estafilococos en su interior. Los Estreptococos también pueden producir un impétigo similar al producido por Estafilococo.
Endocarditis; Meningitis; Otitis y Neumonías.
Enfermedades por hipersensibilidad tras infección estreptocócica no supurativas:
Fiebre reumática: es una complicación de tipo autoinmune que generalmente se expresa en forma de artritis, aunque también puede producir afectación cardiaca originando lesiones en las válvulas del corazón. El elemento desencadenante suele ser una faringitis estreptocócica donde los síntomas aparecen de 1 a 5 semanas después de que la infección original haya desaparecido. Los mecanismos por los cuales se produce esta fiebre reumática son:
ü Los Ag bacterianos que se depositan en las articulaciones y el corazón y cuando el organismo produce Ac contra ellos se originan complejos que podrían ser el origen de la lesión.
ü Los Ag estreptocócicos dan una reacción cruzada con componentes del músculo cardiaco que induce a la producción de Ac que posteriormente lesionarán el corazón.
- Glomerulonefritis: está originada por cepas de Estreptococos que tienen especial afinidad por el riñón.
NOTA: En las enfermedades postestreptocócicas no supurativas el Estreptococo no se encuentra en la lesión sino que ésta se origina por unos complejos como consecuencia de la interacción Ag-Ac (reacciones de hipersensibilidad).
Streptococcus agalactiae B ( b-hemolítico)
Es el agente etiológico más frecuente de sepsis y meningitis neonatal. También puede producir osteomielitis, infección del tracto urinario, endocarditis y neumonías.
Streptococcus de los grupos C y G
Son habituales en la garganta, tracto gastrointestinal y vagina. Pueden producir faringitis y bacteriemia.
Streptococcus bovis del grupo D: Produce endocarditis y bacteriemias
Streptococcus anginosus: produce abscesos y otras infecciones purulentas
Streptococcus pneumoniae; forma parte de la flora normal de la naso-orofaringe y produce neumonía bacteriana extrahospitalaria; otitis, sinusitis y peritonitis y es el segundo agente etiológico productor de la meningitis bacteriana.
Streptococcus del grupo viridans: forma parte del tracto gastrointestinal y respiratorio. Da lugar a infecciones como m.o oportunista. De este grupo los más importantes son S. mutans y S. sanguis I y II
GENERO : ENTEROCOCOS
Son flora normal fecal del hombre y animales. También pueden localizarse en la cavidad oral y en la vagina. Las especies que se aíslan con más frecuencia son: E. faecalis y E. faecium.

GENERO : BACILLUS CEREUS
Es un m.o capaz de producir toxoinfecciones alimentarias que están motivadas por la producción de una enterotoxina. El diagnóstico se suele hacer mediante el aislamiento del germen a partir de los alimentos sospechosos de estar contaminados o bien a partir de las heces de los pacientes.
En ocasiones, B. cereus, puede comportarse como un patógeno oportunista en pacientes inmunodeprimidos.
BACILOS GRAM+ ESPORULADOS. CLOSTRIDIUM
Generalmente se suelen encontrar tanto en el suelo como en el intestino del hombre y los animales.
Aunque se les define como Gram+, en los cultivos de más de 48 horas pueden aparecer como Gram-. Una de las características que presenta este género es la formación de esporas, aunque se producen de manera diferente dependiendo de la especie de Clostridium.
Patogenicidad
Depende de la liberación de exotoxinas y de la producción de enzimas con un alto poder destructivo. Clostridium puede dar lugar a diferentes cuadros clínicos:
Intoxicación alimentaria: Producida por Clostridium perfringens. Es el cuadro clínico más frecuente. Consiste en la aparición de diarrea y dolor abdominal tras la ingesta de alimentos contaminados, generalmente carne. Las enterotoxinas que produce este tipo de Clostridium son las responsables de la infección. Estas toxinas se liberan a partir de las esporas del m.o cuando el alimento permanece a temperatura ambiente después de haber sido conocido. La unión de la enterotoxina a las células epiteliales del intestino altera el equilibrio osmótico y provoca la diarrea.

El diagnóstico de laboratorio se realiza mediante la detección de C. perfringens en el alimento o bien en las heces de los pacientes. También se puede hacer la detección directa de la toxina en las muestras fecales.
Enteriditis necrotizante: Es otro de los cuadros producido por C. perfringens, en este caso del tipo C. Este Clostridium produce una toxina necrotizante que da lugar a una necrosis del tejido intestinal y a una diarrea sanguinolenta que se acompaña de vómitos y dolor abdominal.
El diagnóstico es fundamentalmente clínico ya que, el hecho de aislar o cultivar el m.o, no indica necesariamente que haya infección.
Gangrena gaseosa: El agente causal que se aísla con más frecuencia es Clostridium perfringens y la infección se produce a partir de heridas traumáticas o quirúrgicas contaminadas por el m.o. Consiste en una necrosis muscular y signos de toxicidad sistémica debido a la producción de toxinas citotóxicas.
El diagnóstico se realiza basándose en las manifestaciones clínicas y por la observación en la tinción de Gram de bacilos Gram+ de gran tamaño y con los extremos cuadrados, a partir de muestras obtenidas de los tejidos afectados.
Botulismo: Producido por Clostridium botulinum.. Este Clostridium es capaz de producir una serie de neurotoxinas que son las responsables de la enfermedad. Se reconocen 4 formas clínicas producidas por C. botulinum:
- Intoxicación alimentaria: es la forma más frecuente. Se produce tras la ingestión de alimentos contaminados, generalmente conservas vegetales. La gravedad de la enfermedad va a depender de la cantidad de toxina ingerida. Se manifiesta por una serie de síntomas neurológicos que afectan a la visión, hay afonía, ...
- Botulismo de las heridas
- Botulismo del lactante
- Forma indeterminada: se manifiesta generalmente en niños menores de un año y en ellos no se encuentra la fuente de infección.
El diagnóstico del botulismo es fundamentalmente clínico, aunque se puede demostrar la presencia de la toxina en sangre y del m.o en heridas, tejidos afectados, alimentos, etc.
· Tétanos: Se produce por la potente acción de una neurotoxina elaborada por Clostridium tetani. La enfermedad consiste en una parálisis generalizada debido al bloqueo por la toxina de las uniones musculares de las neuronas motoras. El diagnóstico es fundamentalmente clínico.
· Colitis pseudomembranosa: Producida por las toxinas de tipo A y B que produce el Clostridium difficile. Esta colitis se trata de un cuadro de diarrea tras un tratamiento con antibióticos de amplio espectro que altera la flora intestinal y permiten la multiplicación del m.o. En el laboratorio el método más específico es la detección directa de la toxina en las heces del paciente.

PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS. AGENTES ANTIMICROBIANOS
Los Antimicrobianos son sustancias que se utilizan para tratar enfermedades infecciosas que se pueden obtener de forma sintética en el laboratorio o bien a partir de microorganismos, generalmente hongos. Los precursores de los antimicrobianos fueron Erlich y Fleming.
La diferencia entre Antibiótico y desinfectante está en que el primero es de uso interno, mientras que el último es de uso externo.
CRITERIOS DE VALORACIÓN DE FÁRMACOS ANTIMICROBIANOS
Toxicidad Selectiva, es decir, que sea eficaz exclusivamente con los microorganismos pero que no resulte tóxico para las células del individuo.
No provocar hipersensibilidad (reacciones alérgicas)
Solubilidad en fluidos corporales. Deben penetrar rápidamente. Esta penetración viene dada por la velocidad de degradación y la velocidad de excreción.
El m.o no debe hacerse resistente. Generalmente, los factores que contribuyen al aumento de la resistencia por parte de los m.o son los alimentos ingeridos, personal sanitario, uso inadecuado de antibióticos, etc.
ESPECTROS DE ACTIVIDAD
v Corto espectro
v Amplio espectro (el más usado): su principal ventaja es que cuando investigamos el m.o causante de la infección este medicamento nos proporciona tiempo y provisional tratamiento. La desventaja es que destruyen la flora habitual normal y pueden dar lugar a infecciones secundarias.
ACCIÓN DE LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS
ü Bactericidas: es decir, que matan. Esta acción se desarrolla sobre la síntesis de proteínas del m.o; sobre la actividad enzimática; y sobre la formación de la pared celular.
ü Bacteriostática: es decir, que inhibe o impide el crecimiento de los m.o.


CLASIFICACIÓN
1. a - LACTÁMICOS: su acción consiste en inhibir la síntesis de la pared celular, es decir, que actúan sobre el peptidoglucano. Se obtienen a partir de fuentes naturales así como de antibióticos producidos de forma semisintética. Tienen acción bactericida. Tipos:
1.1 PENICILINAS
Penicilina G: se puede utilizar asociándose con Procaina o Benzatina. Con esto lo que se consigue es aumentar la duración o permanencia del antibiótico en el organismo.
Penicilina V: se administra por vía oral ya que es estable frente al medio ácido del estómago.
Ambas ejercen su acción frente a bacterias Gram+, principalmente pneumococo y S. pyogenes. También se ha demostrado su actividad acción frente a anaerobios, espiroquetas, gonococos y meningococos. Es un antibiótico de corto espectro y baja toxicidad.
NOTA: No ataca a las bacterias Gram- porque el peptidoglucano está protegido por la membrana externa.
Aminopenicilinas: las más significativas con "Ampicilina" y "Amoxicilina". Además de la acción que ejercen la penicilina G y la V, son activas frente a algunas enterobacterias.
Isooxazolilpenicilinas: estos antibióticos se utilizan contra unas cepas de S. aureus que son penicilinasa (b-lactamasas) positivos. Estos m.o son resistentes al resto de antibióticos porque rompen el anillo b-lactámico.
El principal representante de este grupo de antibióticos es la "Meticilina". Otros son la "Oxacilina" y la "Cloxacilina".
Algunas cepas de S. aureus se han hecho resistentes a la Meticilina y se las denomina "SARM"
Carboxipenicilinas: la más importante es la "Carbenicilina". Ejerce su acción frente a todo lo anterior y además actúa sobre las bacterias Gram-.
Ureidopenicilinas: la más significativa es la "Piperacilina" que tiene especial actividad frente a enterococos y otros estreptococos.
1.2 CEFALOSPORINAS:
Su mecanismo de acción es similar al de las penicilinas. Se clasifican por generaciones, según las modificaciones que se han producido en el compuesto a lo largo del tiempo:
1ª Generación: "Cefazolina" de uso parenteral y "Cefactor" de administración oral. Presentan buena actividad frente a bacterias Gram+ y una actividad moderada frente a Gram-.
2ª Generación: "Cefoxitina". Presenta una mayor actividad sobre las bacterias Gram- y se administra tanto por vía oral como por vía parenteral.
3ª Generación: "Cefotaxina" de uso parenteral y "Cefixina" de administración oral. Tienen una peor respuesta contra las bacterias Gram+ pero presentan buena actividad sobre bacterias Gram-.
1.3 CARBAPENEMES
El principal representante de este grupo de penicilinas es el "Iminipen". La característica que presentan es que poseen un espectro de actividad extremadamente amplio. Son activos frente a todos los cocos + y -, bacilos+, anaerobios y la mayor parte de enterobacterias.
Se deben asociar a la cilatina sódica para que no sea degradado en el proceso de filtración del riñón.
1.4 MONOBACTAMAS
Son activos frente a bacterias Gram-, principalmente frente a enterobacterias y pseudomonas.
1.5 INHIBIDORES DE b - LACTAMASAS
Son, por ejemplo, el ácido clavulámico y se utilizan para bloquear la acción de las b - lactamasas y que el antibiótico pueda ejercer su acción.
2. INHIBIDORES DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS
2.1 AMINOGLUCÓSIDOS
Pueden ser naturales o semisintéticos y tienen una actividad bactericida. El más significativo es la "Estreptomicina" que se aplica como antituberculoso, aunque también actúa sobre bacterias Gram-, principalmente el S. aureus.
Puesto que se trata de un inhibidor de la síntesis de proteínas, actúa sobre los ribosomas. Puede inhibir totalmente la síntesis de proteínas o bien conseguir que la célula bacteriana fabrique proteínas defectuosas.
Presentan sinergismo con b-lactámicos, es decir, que la unión de ambos multiplica su acción.
2.2 TETRACILINAS
Son bacteriostáticos. El más significativo es la "Doxiciclina". Presentan el mayor espectro de actividad (Gram+, Gram-, parásitos intracelulares). No es recomendable utilizarlos en niños menores de 8 años porque produce problemas en la dentición y en los huesos. Además suprimen la flora intestinal normal.
2.3 CLORANFENICOL
Son bacteriostáticos. Su espectro abarca a Gram+ y Gram-, clamydias, micoplasmas, espiroquetas,... Normalmente su utilización se reserva para infecciones graves debido a la toxicidad que presentan sobre la médula ósea (afecta la formación de células sanguíneas).
2.4 MACRÓLIDOS
El más significativo es la "Eritromicina" que posee un espectro medio (acción similar a la penicilina G). Actúa sobre las bacterias Gram+, mycobacterias, rickettsias, legionella. Se puede administrar por vía oral.
2.5 LINCOSAMIDAS
Similar a la anterior. La más representativa es la "Clindamicina".


3. QUINOLONAS: Son antibióticos de síntesis, de administración oral. Su acción es bactericida y actúa sobre las bacterias Gram-. Los más importantes son:
Ácido nalidíxico (Actúa a nivel de las vías urinarias)
Norfloxacina (")
Ciprofloxacina (")
4. GLUCOPÉPTIDOS: No tiene relación con otros grupos de antibióticos. El más representativo es la "Vancomicina" que actúa sobre las bacterias Gram+, especialmente contra el S. aureus que es resistente a la meticilina. Tiene una elevada toxicidad renal y ótica.
5. SULFAMIDAS: En muchas ocasiones presenta reacciones alérgicas en el individuo. Son bacteriostáticos y se administran por vía oral. Actúan sobre bacterias Gram+, Gram-, clamidias, parásitos.
Para aumentar la efectividad de las sulfamidas se suelen usar junto al "Trimetropín".
6. NITROIMIDAZOLES: Son bactericidas. Actúan sobre anaerobios y parásitos como la Giardia y Tricomonas. El más representativo es el "Nitroimidazol".
7. POLIPEPTÍDICOS:
Polimixinas: Lesionan las membranas citoplasmáticas y son de uso tópico. Actúan frente a bacterias Gram- (Pseudomonas). Hay dos tipos B y E (colistina).
Bacitracinas: Su mecanismo de acción es similar al de las Polimixinas. Actúa frente a estafilococos y estreptococos del grupo A. Son de uso tópico.
8. OTROS
Nitrofurantoina: oral, vías urinarias. Actúa sobre las bacterias Gram-.
Ácido fusídico: Actúa sobre S. aureus y cepas SARM.
Mupirocina: de uso tópico. Similar al anterior.
Rifampicina: antituberculoso. Actúa frente a bacterias Gram+
Fosfomicina: amplio espectro.
TIPOS DE PRUEBAS DE SENSIBILIDAD
PRUEBAS POR DIFUSIÓN: son pruebas cualitativas que se hacen en medio sólido. Los resultados se informan como:
Sensible Intermedio Resistente
Las pruebas por difusión son las más usadas en el laboratorio por su rapidez y sencillez. A pesar de ello también tienen sus inconvenientes:
Falta de estandarización
Mala conservación de los antibióticos

PROCEDIMIENTO PARA REALIZAR LA DIFUSIÓN EN MEDIO SÓLIDO
Inocular caldo nutritivo (inóculos mas o menos denso). Incubar a 37ºC durante 2-4 horas.
Necesitamos m.o que se encuentren en la fase de crecimiento exponencial, por eso solo incubamos de 2 a 4 horas.
Ajustar al 0,5 de la escala de Mc Farland, que es la que normalmente se observa en las infecciones. Se puede ajustar hacia arriba, añadiendo inóculo, o hacia abajo, añadiendo agua destilada estéril.
Sembrar con la torunda una placa de Mueller-Hinton o, en el caso de Estreptococos en Agar Sangre. Usamos principalmente el Mueller-Hinton porque no contiene carbohidratos, en el crece cualquier m.o y no produce variaciones morfológicas. También podemos usar Soja Tripticasa.
Sumergimos la torunda en el inóculo al 0,5 y escurrimos el exceso rotándola en las paredes del tubo. Pasamos la torunda por toda la superficie de la placa y esperamos de 3 a 5 minutos para que se absorba el inóculo antes de colocar los discos.
Colocar los discos antimicrobianos (15 mm de distancia). Se pueden colocar de forma manual, uno por uno, presionando contra el agar un poco. Nunca se levantarán una vez puestos y se deberán colocar separados uno de otro y del borde de la placa (4-6 discos por placa). Existen unos dispensadores que de una sola vez coloca todos los discos.
Incubar 18-24 horas.
Leer los resultados. Medimos el halo de inhibición (diámetro) y vamos a las tablas donde comparamos los resultados.
PRUEBAS POR DILUCIÓN: informan sobre dos aspectos:
CMI: Mínima Concentración de Inhibición. Es la concentración mínima de antimicrobiano que es capaz de inhibir el crecimiento de bacterias a una concentración de 105 bact./ mL.
CMB: Concentración Mínima Bactericida. Es la concentración mínima de antimicrobiano que es capaz de matar a 105 bact./ mL.
CMA: mínima concentración de antimicrobiano que in vitro es capaz de producir alteraciones morfológicas y/o estructurales (menos importante).
Los métodos por dilución pueden ser en medio sólido y en medio liquido.
En Medio Líquido:
Macrométodo: se utiliza un Mueller-Hinton. Preparamos una serie de tubos estériles con concentración decreciente en base 2 (es decir, 1/2) del antimicrobiano. Inoculamos con un inóculo que contenga 5 x 105 UFC/ mL e incubamos a 35-37ºC durante 18 horas.
Los Resultados se expresan como CMI o mínima concentración de antimicrocbiano donde se observa crecimiento visible a simple vista.
Micrométodo: Utilizamos placas con múltiples pocillos. Pondremos 100 mL de caldo con antimicrobiano y 1-5 mL de inóculo.
En Medio Sólido: sustituimos el caldo por un medio sólido, pero el procedimiento es igual que el anterior.
Fuentes de error de los métodos por dilución:
3 Medio: mal estado, volumen inadecuado
4 Antibiótico: mala conservación, retraso en la inoculación
5 Microorganismo: exceso de inóculo, cultivos viejos, inóculo con más de un m.o, retraso en la siembra, deficiencias en las condiciones de incubación...
CRITERIOS DE INTERPRETACIÓN
· Criterio de poblaciones o ecológico: compara la susceptibilidad que presenta el m.o con respecto al resto de m.o de su especie.
· Criterio farmacológico: tiene en cuenta las propiedades farmacológicas del agente antimicrobiano ya que el objetivo final es que la CMI sea alcanzable en líquidos corporales.
· Criterio clínico: tiene en cuenta la experiencia diaria que se ha adquirido en el tratamiento de una determinada infección. Los resultados pueden ser:
- Sensible: se puede tratar la infección a la dosis recomendada
- Intermedio: dosis altas pero alcanzables
- Resistente: en ningún caso el m.o se inhibe a concentraciones terapéuticas.
MECANISMOS DE RESISTENCIA A LOS ANTIMICROBIANOS. TIPOS PRINCIPALES.
Alteraciones de la permeabilidad tanto del m.o como del fármaco.
G+ G-
Sistema de bombeo acoplado Proteína expulsa fármacos del
Al potencial de membrana: interior celular:
-Proteína transportadora -mecanismo acoplado al potencial de membrana
-Una Porina -mediante energía obtenida de la hidrólisis de ATP
-Proteína nexo entre las otras dos.
Alteraciones del blanco o diana: receptores específicos.
Inactivación enzimática: b- lactamasas y otras enzimas (adenilasas, fosforilasas)
Mecanismo intercambio genético: transformación, conjugación y trasducción.
INTERPRETACION DEL ANTIBIOGRAMA